<< Пред. стр. 15 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
ния процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с рас-
створом красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с
белком красителя ведут, как описано выше, например вымачи-
вая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей
7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях раство-
римость красителя достаточна для вымывания его свободных
молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электро-
форез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и
20% метанола.
Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля- в ван-
ночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля
должно составлять примерно 3:1, при отмывке - 5:1 или даже
10: 1 с двумя-тремя сменами растворителя. Если в растворитель
добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмыв- ку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно опи-
сано выше.
Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специаль-
ном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются
сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впро-
чем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой
электрофореграммы при оценке количественного соотношения
белков в полосах, так как связывание красителя зависит не толь-
ко от концентрации, но и от химического состава и конформации
белка.
Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели
можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиоле-
товому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значи-
тельно легче).
В этом случае необходимо тщательно очищать или перекри-
сталлизовывать акриламид для уменьшения его собственного
поглощения в ультрафиолетовой области спектра.
Другая возможность количественной регистрации электрофо-
реграммы заключается в денситометрировании его фотографии.
В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения коли-
честв белка в полосах может еще усугубиться за счет нелиней-
ности чувствительности фотопленки и других особенностей фото-
графического процесса.
Наиболее надежным способом количественных измерений яв-
ляется счет радиоактивности в белковых полосах при условии
однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее ска-
зано ниже.
После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но впол-
не надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На
92
порядок более высокую чувствительность окраски можно полу-
чить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют
относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Го-
товят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном вод-
ном растворе НС104, фильтрованием освобождаются от крупных,
не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе
вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации
коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окраши-
вает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена
наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не
сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-ко-
ричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель
переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность
окраски полос при этом увеличивается, а фон становится проз-
рачным и светло-голубым - часто его можно не отмывать [Hoi-
brook, Leaver, 1976]. Описан и другой вариант использования
СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H2S04, а затем в
12%-ной ТХУ [Blakesley, Boezi, 1977].
Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда
используют краситель "Fast green FCF" [McMaster-Kaye, Kaye,
1974]. Его можно использовать и для других белков. Он менее
чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных
оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования,
так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем "Fast
green", вымывается из белковых полос, причем иной раз неоди-
наково для различных белков [Bertolini et al., 1976].
Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при
недостаточной продолжительности окрашивания можно столк-
нуться с артефактом - возникновением "двойной полосы". На
самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух
своих торцевых поверхностей.
Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или
в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом.
Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и
протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при
такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и
вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально
иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электро-
фореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе фор-
мальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до
0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пеп-
тиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мости-
ков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами
ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть ра-
зительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных
белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на
самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na
красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас-
93
творе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Na
красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном рас-
творе формальдегида в 25%-ном этаноле [Steck et al., 1980].
Другие красители и методы окрашивания
Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.
Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO3)3+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-.
nauer et al., 1977].
Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием "Stains-all", формула которого представ-
лена ниже.
0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация-0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды-в синий, бел-
ки - в красный, липиды - в желто-оранжевый, ДНК - в синий,
а РНК - в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,
94
который из-за этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18-36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].
Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных рН такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и "Fast green", заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(рI>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные-кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол-вода (1 : 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].
Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра в фотографическом процессе, так как "передержанный"
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.
Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.
95
Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x
x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке ("New Bruns-
wick gyrotory shaker", модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.
Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5-1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNO3+100 мл воды). При этом может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида.
(разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.
Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10-4 мкг/мм2. По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.
Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол - вода - глицерин (70 : 27 : 3) в течение 5 мин.
96
В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.
После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СН3СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин-5%-ной
СН3СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-.
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2CO3,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-.
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2-3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН3СООН,
а затем промывают его водой.
Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].
Флюоресцентные красители
Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических
форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые--
при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их пог-
лощения в растворе лежит в области 330-360 нм, флюоресцен-
ции - 510 нм. Молярная экстинкция E=4,3 · 106.
В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток
присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным
образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность
флюоресцировать сохраняется.
97
Данзилирование белков и пептидов позволяет следить эа хо-
дом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей
длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо
проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции бел-
ков при данзилировании практически не изменяется, поэтому не-
большие примеси данзилированных препаратов можно исполь-
зовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных бел-
ковых смесей.
Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет
проводить пептидный анализ данзилированных белков после их
разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом
удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые,
но и внутренние пептиды. Дело в том, что Данзилирование, хотя
и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам,
происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-
теина и тирозина, ?-NН3-группам лизина и по гистидину. Цен-
ным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-
ных протеаз не создает никаких помех при картировании пепти-
дов.
Недавно описано Данзилирование белков для последующего
разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na
<< Пред. стр. 15 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу