<< Пред. стр. 17 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
лок в 0,05 М Na-фосфатный буфер <рН 7,5) с 0,1% ДДС-Na и
1 мМ ФМСФ ' при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок
в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавле-
нием КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомо-
генизировали кусочки геля в малом объеме 1%-ного раствора
ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая кон-
центрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения
белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окра-
.шивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna
et al., 1980] белки, предназначенные для последующего амино-
кислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в
0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инку-
бацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли
повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая
белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после рас-
творения лиофилизированного препарата в воде до концентра-
ции 1 % по ДДС-Na.
Иногда для улучшения растворения осажденного в геле бел-
ка экстракцию ведут в 1%-ном ДДС-Na с 6 М мочевиной [Buis-
son et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина мож-
но экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rab-
bani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза
и окраски СВВ R-250 можно также элюировать 66%-ной уксус-
ной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке
ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей
природе краситель десорбируется с белка и полностью задержи-
вается на анионообменнике, а щелочные рибосомальные белки
с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980].
Описан способ экстракции белков в комплексе с ДДС-Na
60%-ной муравьиной кислотой [Gibson, Cracy, 1979], которую
------
1 Фенилметилсульфонилфторид - ингибитор протеаз.
105
затем упаривают, а сухой остаток суспендируют в 6 н. НС1. Бе-
лок при этом растворяется, а ДДС-Na остается в осадке. Его
удаляют центрифугированием, а краситель из раствора белка в
кислоте извлекают троекратной экстракцией октанолом. Соля-
ную кислоту удаляют высушиванием в струе азота, разбавив
предварительно препарат водой.
Возможен и другой подход. Сначала ДДС-Na и краситель
экстрагируют из ПААГ без растворения осажденного в полосах
белка. Этого добиваются пятикратной гомогенизацией геля в
растворе, содержащем 10% ТХУ и 30% этанола. Гель каждый
раз осаждают центрифугированием. Из очищенного таким обра-
зом геля белки экстрагируют 0,1 М NaOH в течение 2 ч при 37°
при встряхивании [Djondjurov, Holtzer, 1979]. Для малых кон-
центраций белков в полосах этот метод не подходит, так как
часть белков вымывается при обработке геля ТХУ.
Нефиксированные белки удобно извлекать из геля возобнов-
лением электрофореза до выхода белка из геля. Содержащую
нужный белок полосу (или пятно) в геле локализуют сопостав-
лением с окрашенными белками в параллельном контрольном
треке на пластине, который предварительно отрезают, или в конт-
рольной трубке. Можно фиксировать положение полос и с по-
мощью данзилированных маркеров (см. выше). Вырезанный из
геля участок помещают в трубку на небольшую "пробку" из
крупнопористого ПААГ или агарозы и заливают буфером, а на
нижний конец трубки надевают заполненный буфером диализ-
ный мешочек. Затем возобновляют электрофорез и ведут его до
тех пор, пока белок не выйдет из трубки в мешочек [Weliky
et al., 1975]. Особенно удобно следить за выходом белка при на-
личии данзилированных маркеров. Если находящийся в диализ-
ном мешочке буфер содержит в избытке неионный детергент
(2% NP-40) и 8 М мочевину, то ДДС-Na практически полностью
вытесняется из связи с белком и уходит через мембрану к аноду
[Tuszynski et al., 1977].
Описан вариант, при котором белок электрофоретически
элюируют в трубку большего диаметра, где на пробке из ПААГ
лежит слой оксиапатита, уравновешенного 0,1 М Na-фосфатным
буфером (рН 7,2) с 0,1% ДДС-Na. Несмотря на действие элект-
рического поля, белок собируется на оксиапатите, откуда его
затем, разобрав всю систему, можно элюировать 0,5 М фосфат-
ным буфером [Ziola, Seraba, 1976].
Нитроцеллюлозные мембранные фильтры обладают способ-
ностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользо-
ваться для получения "реплики". Фильтр накладывают на по-
верхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки
тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно
такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре мож-
но проводить идентификацию белков, например гибридизацией
их с меченной 32Р ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устрой-
ство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы,
106
показано схематически на рис. 29. К пластине геля с двух сторон
металлическими сетками через пропитанные буфером поролоно-
вые прокладки прижимают нитроцеллюлозные фильтры (18x
x18 см) рабочей поверхностью к гелю. Фильтры предваритель-
но смачивают буфером, чтобы в них не оставалось окклюдиро-
ванного воздуха. Для этого следует дать им некоторое время по-
плавать на поверхности буфера, а потом уже погрузить в него.
Если электрофорез шел в присутствии ДДС-Na, белки пред-
Рис. 29. Устройство для диф-
фузии белков из геля на нит-
роцеллюлозный фильтр [Bo-
wen et al., 1980]
/ - сетка из нержавеющей стади;
2 - поролон; 3 - нитроцеллюлоз-
иый фильтр; 4-ПААГ
варительно освобождают от него, вымачивая гель в 0,01 М рас-
творе Трис-НСl (рН 7), содержащем 0,05 М NaCl, 2 мМ ЭДТА
и 4 М мочевину, в течение 3 ч с перемешиванием. Для более
полного освобождения от ДДС-Na в этот раствор можно сначала
ввести 1% Тритона Х-100, а потом отмывать тем же буфером без
детергента. Собранную, как описано выше, многослойную систе-
му погружают в 2 л того же буфера, но без мочевины. Диффузия
идет при комнатной температуре в течение 36-48 ч с одной сме-
ной буфера.
Белки на фильтре можно окрасить, а .радиоактивные-обна-
ружить флюорографией (см. ниже). Для этого высушенный
фильтр ненадолго замачивают в 10%-ном растворе ППО в эфи-
ре и накладывают на него рентгеновскую пленку. Флюорогра-
фия или авторадиография с фильтра идет значительно лучше,
чем с геля, так как белки сорбируются на поверхности мембран-
ного фильтра.
Выход белков из геля на фильтр можно значительно уско-
рить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пла-
стины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это
было описано для электрофоретической отмывки красителя
[Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как
в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-
лозный фильтр ("Millipore НА") накладывают на гель только с
одной стороны - той, куда будут мигрировать белки под дейст-
вием электрического поля. Весь "сэндвич" помещают в прибор
для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение
так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см.
Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (напри-
мер, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех
компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в
0,7%-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из
геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел-
107
люлозе. Однако не следует допускать перегрузки фильтра: его
сорбционная емкость составляет примерно 0,15 мкг белка на
1 мм2 поверхности. Для проверки можно вслед за первым поло-
жить второй листок нитроцеллюлозы - на нем не должно быть
белка.
Если разделение белков вели в комплексе с ДДС-Na, то и
элюировать их можно в этом комплексе. В таком случае следует
использовать буфер того же типа, какой используют для верхне-
го электродного резервуара ступенчатой системы электрофореза
по Лэммли (0,192 М глицин, 25 мМ Трис, 20%-ный метанол; рН 8,3). Направление миграции белков-к аноду. Выход белка
при этом получается неполным.
Перешедшие на фильтр белки Таубин и соавторы идентифи-
цировали иммунологически. Подробное рассмотрение метода вы-
ходит за рамки этой книги, поэтому ниже он описан лишь вкрат-
це. Фильтр вымачивали в 3%-ном растворе бычьего сывороточ-
ного альбумина для насыщения оставшихся свободными центров
сорбции, затем инкубировали с антисывороткой к интересующе-
му белку, промывали и инкубировали с "индикаторными" анти-
телами к иммуноглобулинам первой сыворотки, конъюгирован-,
ными с флюоресцентным красителем или меченными радиоактив-
но. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр
существенно облегчает их иммунологическую идентификацию,
так как крупные молекулы ?-глобулинов плохо диффундируют
в гель, тогда как фильтр сорбирует белки на своей поверхности
и они легко доступны для антител.
Описанный прием идентификации можно использовать во
всех случаях, когда белок способен образовывать специфические
комплексы (гормон-рецептор, рецептор-цАМФ, белок-нукле-
иновая кислота и др.), - конечно, при условии, что его активные
группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу.
Впрочем, последнее требование может относиться лишь к неболь-
шой доле молекул белка данного типа, достаточной для иденти-
фикации всей полосы.
Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распро-
странение этого метода на любые белки связано с использова-
нием так называемой "диазобумаги", на которой предварительно
закреплены афинные сорбенты, например: антитела или антиге-
ны [Eriich et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла
себе применение главным образом для гибридизации нуклеино-
вых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для
описания ее особенностей. Отметим только способ переноса бел-
ков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в си-
стеме Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М Na-фосфатным
буфером (рН 7,4) с 0,15 М NaCl и 0,5% Тритона Х-100 при ком-
натной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку
фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером,
накрывают диазобумагой, а ее - несколькими слоями сухой
фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян-
108
ную пластинку грузом. Буфер, поднимающийся из кюветы через
гель к сухой фильтровальной бумаге, за 1-2 ч при комнатной
температуре вымывает основную массу белка из геля. Нужный
белок задерживается на афинном сорбенте, остальные же уходят
дальше, в фильтровальную бумагу.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ БЕЛКОВ
ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ
Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио-
активности белков, а также способы оценки эффективности этих
методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в
очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы
оценки радиоактивности белков после их электрофореза в
ПААГ.
Счет радиоактивности в элюатах белка
Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.
Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок-
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных фильтрах типа "Millipore НА". К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа "Millipore" здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок-ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].
Для качественного определения радиоактивности 14С и 125I
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа "Whatman GF" или даже на
бумажном фильтре "Whatman N 1". Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].
109
Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю-
чает диффузию нефиксированных комплексов белок-ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
.сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].
Растворение ПААГ
Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить
растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по-
вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода.
Если белки мечены 14С, то к раствору Н2О2 следует добавить
NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный
14СО2. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в
такой смеси при 65° в течение 4-6 ч и далее просчитывать ра-
диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако
эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз-
можность артефактов - тушения и хемолюминесценции - вы-
ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного
растворения геля в Н2О2 с NH4OH иногда предпочитают исполь-
зовать один из фирменных "солюбилизаторов" и считать радио-
активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-
zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в
30%-ной Н2О2 с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил-
лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз-
ванием "Aquasol". Для подавления хемолюминесценции щелоч-
ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле-
дяной уксусной кислоты.
Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и
без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю-
билизаторов. Так, "Soluene" фирмы "Packard" растворяет ПААГ
в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60-
65°. В солюбилизаторе NCS фирмы "Nuclear Chicago" при ана-
логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и
выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN ("New Eng-
land Nuclear") рекомендует для обработки ПААГ использовать
3%-ный раствор солюбилизатора "Protosol" в сцинтилляцион-
ной смеси под названием "Econofluor". За ночь при 37° гель на-
бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец,
недавно был предложен специальный "коктейль", содержащий
6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл "Hyamine 10X hydroxide" в 1 л то-
луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера-
туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].
Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето-
дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в
ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-
110
шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари-
тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе-
ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора "Soluene 350" в то-
луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято-
ра MSB фирмы "Packard". Для ускорения процесса можно
предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл "Solue-
ne 350" при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же
толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав-
ляет около 60%, а выход достигает 90-95%.
<< Пред. стр. 17 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу