<< Пред. стр. 2 (из 6) След. >>
Список литературы по разделу
ДНК.
ДНК всегда существует в виде двойной спирали (рис.8), исключение составляют ДНК некоторых вирусов. Модель строения ДНК в виде регулярной двойной спирали была предложена в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Исследования показали, что она верна. Обе цепи вместе удерживает комплементарность пар азотистых оснований. Между комплементарными основаниями A-T и G-C, которые называются парами Уотсона и Крика (рис.5), спонтанно образуются водородные связи. Между А и Т образуется две водородных связи, а между G и C - три. Другие комбинации оснований не являются комплементарными.
Водородные связи слабые, они легко рвутся. Например, при повышении температуры до 950 происходит плавление ДНК, т.е. отделение цепей друг от друга за счет разрыва водородных связей. Однако при охлаждении водородные связи вновь образуются, и двуспиральная структура ДНК восстанавливается, этот процесс называется ренатурацией ДНК.
Вследствие комплементарности оснований в одной молекуле ДНК количество G равно C, а количество А равно количеству Т. Это называется правилом Чаргаффа. Естественно, что разные ДНК различаются по количеству пар А-Т и G-C. В ДНК половой клетки человека 3,2 млрд. пар нуклеотидов.
Из описанной структуры ДНК следует, что две цепи ДНК можно представить в виде лестницы, в которой сахаро-фосфатные остовы удерживают обращенные внутрь спаренные основания - ступени.
Поскольку азотистые основания ДНК гидрофобны, они в структуре ДНК должны быть уложены так, чтобы исключить их контакт с водой. Это как раз и достигается сближением оснований и укладкой их в спираль, в которой гидрофильные сахаро-фосфатные группы оказываются снаружи, а гидрофобные основания внутри. Спираль правозакрученная и имеет большой и малый желобки (рис.9). Часть каждого основания " видна " как из большой, так и из малой бороздки, поэтому они доступны для взаимодействия с другими молекулами. Описанная конформация ДНК называется В-формой. Однако это не единственно возможная конформация ДНК. Например, при дегидратации ДНК приобретает форму А, а именно, более сплющенную форму с большим наклоном оснований относительно оси. Известно, что А-форма характерна для спор бактерий. Возможна и Z-форма ДНК, когда обе цепи закручены влево. Есть предположение, что А- и Z-формы могут образовываться на коротких участках ДНК и обеспечивать регуляцию ее функции.
Рис.8. Схема двойной спирали ДНК
Цепи ДНК антипараллельны, т. е. 3'ОН-концу одной цепи соответствует 5'ОН- конец комплементарной цепи. Например, последовательность нуклеотидов в небольшом фрагменте ДНК должна быть записана так
5'ЦАТГТА3'
3'ГТАЦАТ5'
Чаще всего пишут последовательность только одной цепи, подразумевая, что вторая комплементарна первой. При этом можно даже не обозначать концы молекулы, если условиться, что всегда последовательность оснований записывается с 5'-конца. Поэтому последовательность нуклеотидов в приведенном выше фрагменте можно изобразить как ЦАТГТА.
Рис.9. Схема В-формы ДНК
4.1.2. Размеры ДНК и ее упаковка в клетке
В ядре каждой соматической клетки человека содержится 23 пары хромосом, длина всех 46 молекул ДНК в одной клетке равна около 2 м. Если принять, что организм взрослого человека состоит из приблизительно 5.1013 клеток, то общая длина молекул ДНК у человека составит 1.1011 км , т.е. в тысячи раз превышает расстояние от Земли до Солнца. Естественно, что ДНК должна быть в значительной степени компактизована, чтобы поместиться в хромосомах ядра (рис.10). В эукариотических клетках ДНК находится в комплексе с белками. Этот комплекс называется хроматином. Белки в основном представлены гистонами, которые благодаря своему положительному заряду, образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. Пары гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н3 образуют октамер, вокруг которого ДНК совершает 1,75 оборота. Этот комплекс называется нуклеосомой.
Нуклеосомы соединены линейными участками ДНК- линкерами, так что ДНК имеет вид нитки бус (до 11 нм в диаметре). Но такой упаковки еще не достаточно. Дальнейшая упаковка ДНК приводит к образованию нити толщиной в 30 нм. И далее 30-нм нити образуют длинные петли. Возможно, что петли, образуемые с участием негистоновых белков, формируют также складки и спирали.
Рис. 10. Уровни упаковки хроматина
Теперь попытаемся связать описанную структуру с хромосомой. В наиболее конденсированном состоянии ДНК находится в митотических хромосомах, готовых к транспортировке в каждую из дочерних клеток. При этом наиболее упакованная область приходится на центромеру, на внешней поверхности которой расположены белки кинетохора. Именно к кинетохору во время разделения дочерних хромосом присоединяются микротрубочки веретена деления. В теломерных концах хромосом также наблюдается большая конденсация ДНК. В интерфазных хромосомах ДНК менее упакована, однако эта упаковка неодинакова по всей ее длине. Наиболее конденсированы участки ДНК, свободные от генов - гетерохроматин, наименее - участки, содержащие гены - эухроматин. Гетерохроматин транскрипционно неактивен, эухроматин, наоборот, является активным.
Совокупность ДНК в клетке называется геномом. Исследования показали, что нет четкой зависимости между величиной генома (длиной ДНК) и эволюционным статусом вида. Конечно, у бактерий и вирусов ДНК меньше, чем у многоклеточных. Но у человека ДНК в геноме столько же, как и у гороха или кукурузы, но в 5 раз меньше, чем у репчатого лука и в 20 раз меньше, чем у сосны. Лягушки, жабы и тритоны по содержанию ДНК относятся к чемпионам. Исследования в рамках программы "Геном человека" показали, что в геноме человека содержится 38 тысяч генов, структур, кодирующих белки или РНК. Это составляет едва ли 3% ДНК. Функция остальной ДНК пока остается не ясной. Создается впечатление, что гены - это небольшие островки в море неактивных информационных последовательностей ДНК. Кроме генов, в ДНК находятся многие некодирующие повторяющиеся последовательности. К примеру, 10% всего генома человека занимает семейство так называемого Alu-повтора длиной в 300 пар нуклеотидов, составляющего до полумиллиона копий. В области центромеры хромосомы находятся сателлитные повторы ДНК, состоящие из коротких последовательностей, повторяемых тандемно так, что длина каждого фрагмента достигает 10 000 пар оснований ДНК. Есть и другие повторяющиеся последовательности, разбросанные по ДНК.
Последовательности в ДНК не всегда жестко фиксированы. Иногда некоторые фрагменты ее могут перемещаться из одного места в другое. Они называются транспозонами.
4.2. РНК
Содержание РНК в клетках во много раз больше, чем ДНК. Основная роль РНК - это транскрипция генетического материала и синтез белков, или трансляция. РНК может быть также и носителем генетической информации - в РНК-содержащих вирусах. В клетке РНК существует в виде информационных (мРНК), транспортных (тРНК), рибосомных (рРНК), малых ядерных (мяРНК) и малых цитоплазматических (цяРНК). РНК - это полинуклеотид (рис. 11), длиной до 10000 нуклеотидов. В ее состав входят 4 нуклеотида: аденин, цитозин, гуанин и урацил. Вместо тимина, присутствующего в ДНК, в РНК находится урацил, у которого в отличие от тимина, отсутствует 5'-метильная группа. Как и в ДНК, в РНК нуклеотиды соединяются 5'-3'- фосфодиэфирными связями. В тРНК довольно часто встречаются модифицированые нуклеотиды.
Большинство клеточных РНК - одноцепочечные молекулы, но в них часто образуются двуцепочечные участки - шпильки - за счет спаривания комплементарных нуклеотидов.
4.3. Генетический код
Самым сложным в проблеме кода было понять, что он существует. На это ученым понадобилось целое столетие. В начале 40-х годов Дж. Бидл и Э.Тэйтум выдвинули свой знаменитый тезис "Один ген - один фермент". В настоящее время в своей первоначальной форме этот принцип имеет скорее исторический интерес, однако заслуживает восхищения, поскольку он стимулировал создание целой научной области - молекулярной биологии гена, в которой гены были главным предметом исследования. Успехи этих исследований позволили ответить на вопрос, что и как записано в генетическом коде.
Генетический код - это способ записи генетической информации о структуре белков в последовательностях нуклеотидов РНК или ДНК. Поскольку генетический код считывается с мРНК, его обычно записывают, используя основания мРНК - А, U, G и C. В конкретном смысле - это соответствие между кодонами матричной РНК и аминокислотами кодируемого белка.
Определение и сама концепция гена подвергались эволюции. В 1865 году Грегор Мендель опубликовал статью, в которой на основании своих экспериментов постулировал существование единиц наследственности в виде дискретных факторов, которые передаются от родителей потомству. Теперь мы знаем, что это и есть гены.
Свойства генов отражены в законах Менделя. Первый закон - единообразия гибридов первого поколения - рассматривает свойства индивидуального гена. При этом диплоидный организм имеет две копии гена, находящиеся в гомологичных хромосомах. В процессе мейоза только по одной из этих копий попадает в гаметы, которые гаплоидны. Сливаясь, они образуют зиготу, в которой по одной копии гена от каждого родителя. Ген может существовать в альтернативных формах, что проявляется в фенотипических различиях, например, красная и белая окраска цветков. Эти формы гена называются аллельными. Аллельные гены отличаются небольшими изменениями последовательности нуклеотидов в ДНК, которые в одних случаях приводят к изменениям кодируемого продукта и изменению фенотипа, а в других - никакого влияния на кодируемый продукт не оказывают. Уникальное сочетание аллельных состояний всех пар генов и определяет биологическую индивидуальность каждого организма. Если аллели одинаковы, организм гомозиготен по ним, если разные - гетерозиготен. Скрещивание двух гомозиготных особей дает гетерозиготу, в которой один аллель гена проявляется (доминантный), а другой - нет (рецессивный). Поэтому в первом поколении все особи одинаковы по фенотипу (а также по генотипу) и похожи на доминантного родителя. Однако рецессивный ген никуда не девается и в последующих поколениях проявляется. Поведение любой пары альтернативных генов не влияет на распределение другой пары генов.
Работа Г. Менделя не была замечена и не повлияла на бытовавшее тогда представление о наследственности. Вторичное открытие генетических законов состоялось в 1900 году Г. Де Фризом (Голландия), К. Корренсом (Германия) и Э.Чермаком (Австрия). Это убедило всех в существовании дискретных наследственных факторов.
С открытием хромосом стало ясно, что дискретные факторы Менделя соответствуют хромосомам - альтернативные гены находятся в гомологичных хромосомах. Законы Менделя получили цитологическую основу (рис.13). В мейозе при образовании гамет - каждая гамета получает только одну из двух гомологичных хромосом своих родителей. При этом каждый член одной гомологичной пары входит в гамету в случайном сочетании с другим членом другой гомологичной пары хромосом. Это правило независимого распределения негомологичных хромосом.
С развитием генетики были обнаружены исключения из законов Менделя, которые основу этих законов подтверждают.
Далее гены идентифицировали, только исходя из мутаций, которые вызывали отклонения в фенотипе. И уже в 1902 году Герродом была высказана мысль, что мутации приводят к нарушению метаболизма (на примере алкаптонурии). Появились попытки связать гены с ферментами. Они предприняты Дж. Бидлом и Э. Тейтумом в 30-х годах. Это привело в 1940 году к возникновению гипотезы - один ген - один фермент. Однако прямого доказательства, что ген действительно детерминирует структуру белка, пришлось ждать до 1957 года, когда Ингрем показал, что серповидно-клеточная анемия наследуется как моногенный признак и обусловлена изменением аминокислотного состава гемоглобина. Но поскольку выяснилось, что гемоглобин состоит из двух ?- и двух ?- полипептидных цепей плюс группировки гема, а функция его может быть изменена при мутации, затрагивающей любую цепь, гипотеза получила более точное выражение - один ген - одна полипептидная цепь.
Следующий этап исследований генов состоял в выяснении их биологической природы. Начало положили эксперименты Ф.Гриффитса в 1928 году, который открыл явление
Pодители Р А А а а
Гаметы
А А а а
Первое поколение гибридов F1
А А а А
Гаметы
А а а А
Второе поколение гибридов F2
а а а А а А А А
Рис.13. Иллюстрация цитологических основ
законов Менделя.
трансформации при изучении пневмококковой инфекции у мышей. Если он инфицировал мышей смесью живых авирулентных пневмококков и убитых нагреванием вирулентных, мыши погибали. Значит, какой-то компонент убитых бактерий превращал невирулентных в вирулентные. В 1944 году Эвери показал, что трансформирующим агентом является ДНК. Это было неожиданным. Хотя уже знали, что ДНК является основным компонентом эукариотических клеток, никто не предполагал, что она входит в состав пневмококков. Эвери так подробно описывает полученное им трансформирующее вещество, что нам не трудно увидеть в нем ДНК! Однако еще долгое время оставалось скептическое отношение к ДНК как генетическому материалу, в основном из-за ошибочного представления о монотонности структуры ДНК. Обескураживало также и то, что молекула ДНК намного длиннее белка.
После выяснения Уотсоном и Криком структуры ДНК стало понятно, что именно ДНК - носитель генетической информации и начался следующий этап - изучение молекулярной структуры генов и генетического кода. Представление о том, что каждая цепь ДНК служит матрицей при синтезе комплементарной цепи при репликации ДНК, оказалось главным для формирования представлений о природе генов и их связи с синтезом белка.
Первое определение гена на молекулярном уровне предложено в начале 40-х годов 20 века на основании изучения генетики нейроспоры. Это привело к формулировке - ген - это область, кодирующая один фермент. Затем это понятие уточнили еще более - ген - это область ДНК, кодирующая одну полипептидную цепь белка или одну структурную РНК (тРНК, рРНК, мяРНК). Этим представлениям не противоречил открытый в 70-х годах феномен прерывистости генов эукариот. А вот открытие альтернативного сплайсинга определенно требует внесения поправки в определение гена. Подходит такое определение - ген - это последовательность ДНК, которая транскрибируется как отдельная единица и кодирует одну или несколько полипептидных цепей белка или РНК.
Выяснение структуры генов изменило их определение. Гены могут быть прерывистым, по образному выражению Уолтера Гилберта, состоят из кусков (экзон-интронное строение), могут перекрываться (считывание с разных рамок), за счет альтернативного сплайсинга один ген может кодировать разные полипептиды. Как, исходя из этого, дать определение гена? Получается, что правильным является утверждение - одна полипетидная цепь - один ген. В этом случае мы можем считать геном последовательность ДНК (экзоны и интроны), отвечающую за синтез полипептида, игнорируя то, что в него входит другой ген, кодирующий другой полипептид.
Самый трудоемкий и дорогостоящий в истории биологии международный проект "Геном человека" практически завершен в 2001 году. В феврале 2001 года опубликована последовательность нуклеотидов в геноме человека. Пока в нем содержится много пробелов и неточностей. Однако уже сейчас можно сделать ряд принципиальных заключений.
Кодирующая часть ДНК человека составляет не более 3%, остальная представлена интронами генов, повторяющимися последовательностями и межгенными участками.
В человеческом геноме 31780 генов по данным Международного проекта "Геном человека" и 39114 генов по данным коммерческой фирмы Celera genomics. В то же время протеом человека содержит более 250000 различных белков. По-видимому, геном экономно использует гены. (См. гл.8 об альтернативном сплайсинге)
Типичный ген человека содержит 28000 пар оснований и имеет в среднем 8 экзонов. При этом кодирующая его часть состоит из 1340 п.н. и кодирует белок, сотоящий из 447 аминокислотных остатков. Самый большой ген - ген белка дистрофина. В нем 2,4 млн. пар нуклеотидов. Наибольшее число экзонов в гене титина, белка, ответственного за пассивную эластичность скелетных мышц. 3% генов могут транскрибироваться с различными рамками считывания.
40% мРНК подвергаются альтернативному сплайсингу. Таким образом, одна последовательность ДНК может кодировать более одного вида мРНК и несколько разных пептидов.
Практически каждый ген человека имеет вариабельность в нуклеотидной последовательности. В некоторых генах, например, генах системы главного комплекса совместимости тканей, полиморфизм беспрецедентен. Биологическая значимость генетического полиморфизма очевидна. Например, делеция 32 п.н. в гене хемокинового рецептора приводит к устойчивости людей к заражению вирусом иммунодефицита человека. Сравнивая полиморфизм в определенных генах у больных и здоровых людей, можно установить те вариации, которые ассоциированы с заболеванием.
Подготовлен список 923 генов, вызывающих моногенные наследственные заболевания и повышающие шанс развития заболеваний.
ДНК, не кодирующая ни белки, ни РНК, составляет более 50% генома. Френсис Крик назвал ее эгоистической или паразитической. Эта ДНК состоит из повторяющихся последовательностей. Клонирование их затруднено или невозможно, поэтому они фактически не расшифрованы. Именно такая ДНК обусловливает явление так называемого С парадокса (от content-содержание). Парадокс в том, что нет корреляции между количеством ДНК в геноме и положением организма на эволюционной лестнице.
Считается, что эгоистическая ДНК возникла в результате обратной транскрипции. Повторы делятся на 5 классов:
1. Короткие рассеянные по всему геному повторы, возникшие из подвижных элементов. Они составляют около 45 % генома.
2. Псевдогены, т.е. неактивные копии генов
3. Простые повторы, состоящие из 1-13 оснований - микросателлиты, либо длинные, состоящие из 14-500 оснований минисателлиты (3%)
4. Повторы больших сегментов ДНК (5%)
5. Тандемные повторы в центромерных и теломерных участках
В геноме человека обнаружено 223 гена, продукты которых похожи на белки бактерий. Считается, что это результат горизонтального переноса генов.
Секвенирование генома человека показало его усложнение по сравнению с другими организмами. В геноме человека по сравнению с другими представителями животного мира увеличено число генов, участвующих в иммунологических процессах, в развитии и функционировании нервной системы, транскрипции, трансляции и апоптозе. Тем не менее, в геноме человека наблюдается сравнительно небольшое увеличение генов, кодирующих белки - в 2 раза больше, чем у червя C. elegans и мухи D. melanogaster. Значит, усложнение генома человека связано не с увеличением числа генов, кодирующих белки, а с увеличением числа белков за счет сложных механизмов регуляции, альтернативного сплайсинга, посттрансляционной модификации, нелинейной сети регуляторных процессов.
Полученные сведения о геноме человека окажут со временем огромное влияние на медицину и на всю нашу жизнь. Уже сейчас ощущаются выгоды от полученных результатов - появились новые методы генетического тестирования, находящие применение в медицине и криминалистике, методы генной терапии, трансгенеза и т.д., сопряженные, правда, с рядом этических проблем. Однако для полномасштабного использования результатов выполненного проекта дело дойдет не скоро. Сейчас ученые только прочли всю последовательность нуклеотидов в хромосомах человека. Если эту информацию записать на бумаге, она займет 6000 км, 200 томов по 1000 страниц каждый. Однако не гигантский объем информации является препятствием для ее использования, а то, что мы фактически мало знаем о ее назначении. Оказалось, что геном человека включает всего 30 000 генов, занимающих около 3% ДНК. Остальная часть ДНК некодирующая. Представление о том, что она является мусорной, не доказано. Основатель проекта Джеймс Уотсон считает, что полученную информацию придется осмысливать в течение нескольких десятилетий. Второй этап исследований как раз и связан с изучением функций генома. В 1998 году стартовали два проекта - немецкий и американский, посвященные сопоставлению геномов приматов, отряда, к которому принадлежит и человек. Еще Клавдий Гален во II веке н.э. проанатомировав много обезьян, сказал, что это "смешные копии" людей. В настоящее время выяснено, что обезьяны и люди похожи не только внешне, но и на уровне ДНК. ДНК человека и шимпанзе идентичны более чем на 90%. Между тем перепутать человека и шимпанзе мудрено. Парадокс! Какие же гены делают человека человеком? Пока это остается загадкой. Но уже есть предположение, что изменения не в генах, а в их регуляции.
5. 1. Генетическая система митохондрий
Митохондрии - важнейшие клеточные органеллы, присутствующие во всех ( за небольшим исключением) эукариотических клетках. В них осуществляются реакции окислительного фосфорилирования, идущие с выделением энергии, которая запасается в макроэргических связях АТФ. Митохондрии, как и пластиды, относительно автономны. Митохондрии окружены двойной мембраной и имеют собственный генетический аппарат, обладающий рядом особенностей.
ДНК митохондрий кольцевая двуспиральная. В митохондриальном геноме человека 16569 пар нуклеотидов, кодирующих 13 белков, 22 тРНК и 2 рРНК.
В генетическом коде митохондрий имеется ряд отклонений от универсальности генетического кода. Так, в митохондриях человека кодон AUA кодирует метионин, а не лейцин, как в универсальном коде. Кодоны AGA и AGG, кодирующие в ядерном коде лейцин, в митохондриях являются терминирующими кодонами, а стоп-кодон UGA кодирует в митохондриях аминокислоту триптофан.
Другой необычной чертой генетической системы митохондрий являются особенности узнавания кодонов мРНК антикодонами тРНК. Одна митохондриальная тРНК узнает 4 кодона, различающиеся третьим нуклеотидом, так что в синтезе белка в митохондриях используется всего 22 тРНК, а не 62, как в цитоплазме эукариотической клетки.
В митохондриях сильно развито редактирование мРНК. Обычно это замена C на U в определенных местах.
В митохондриальной мРНК происходит сплайсинг. При этом вырезаемые интроны могут кодировать белки-матюразы, которые и осуществляют вырезание интронов.
В митохондриальной ДНК иногда наблюдается перекрывание генов. Так, в митохондриях курицы ген тирозиновой тРНК перекрывается одним нуклеотидом с геном цистеиновой тРНК.
Размножаются митохондрии делением, никогда не возникая de novo.
Рибосомы митохондрий очень мелкие, при этом в них отсутствуют малая рибосомная единица и многие белки рибосом. Эти особенности обусловливают нечувствительность митохондрий к антибиотикам, эритромицину и хлорамфениколу (левомицетину), ингибирующим синтез белка в бактериях. Поэтому указанные антибиотики менее токсичны для человека.
Поскольку митохондрии находятся в центре энергетического обмена клетки, любое нарушение в них не может не отразиться на основных функциях организма. Клеточный энергетический кризис ведет к включению механизма запрограммированной гибели клетки - апоптозу. Вообще митохондрии представляют центр контроля апоптоза. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм кислорода, последние инициируют открытие пор во внешней мембране и выход в цитозоль белка, ответственного за развитие каскада реакций, ведущих к синтезу протеаз и нуклеаз и к апоптозу.
Нарушения в геноме митохондрий наследуются по материнской линии, поскольку новорожденный получает их из яйцеклетки. Митохондрии сперматозоидов при оплодотворении не попадают в яйцеклетку. У человека выявлен ряд наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в митохондриальной ДНК. К ним относятся энцефало- и миелопатии, аритмии, ацидоз, некоторые виды глухоты и слепоты.
5. 2. Геномы вирусов
У вирусов разнообразны способы хранения генетической информации и ее реализации. Оба типа нуклеиновых кислот используются вирусами для записи и хранения генетической информации. При этом в вирусах они встречаются во всем разнообразии форм - односпиральные, двуспиральные, линейные, кольцевые и фрагментированные.
Большинство вирусов полиомиелит, вирус табачной мозаики, вирус клещевого энцефалита и др.) содержат РНК (+РНК), которая при попадании вируса в клетку сразу начинает транслироваться. В результате образуются вирусные белки, необходимые для размножения вируса, в частности РНК-зависимая РНК-полимераза. По сути, эти вирусы представляют мРНК, в изящной и надежной упаковке из белка. Чтобы начать инфекционный процесс, им ничего не нужно, кроме белоксинтезирующего аппарата клетки. Однако в естественных условиях в клетку попадает немного вирусных частиц и их мРНК трудно выдержать конкуренцию с клеточными мРНК за рибосомы.
Есть вирусы ( вирус гриппа, кори, бешенства, желтой карликовости картофеля и др.), в геноме которых находится РНК (- РНК), комплементарная той, которая будет транслироваться. Кроме того, в их вирионе вместе с -РНК упакован фермент РНК-зависимая РНК-полимераза. Она копирует РНК, с образованием +РНК, которая, как и в первом случае, использует рибосомы клетки для синтеза своих белков. У другой группы вирусов, к которой относятся ротавирусы, вызывающие кишечные расстройства, РНК двуспиральная (? РНК), а также имеется фермент РНК-зависимая РНК-полимераза, Новое поколение вирусов образуется по сходному с предыдущим механизму.
У вирусов - возбудителей герпеса и оспы, в геноме находится двуспиральная ДНК, которая сначала транскрибируется, а потом трансляция мРНК приводит к образованию вирусных белков и вирионов. Ферменты, необходимые для осуществления этих процессов, вирус берет у клетки.
Вирусы с односпиральным ДНК-геномом сначала его дуплицируют, а затем все происходит, как в предыдущем варианте.
Ретровирусы - ВИЧ (см. рис.3) и онкогенные вирусы, имеют +РНК, но сценарий, по которому развивается инфекционный процесс, отличается от описанного в пункте 1. В вирусном геноме закодирован необычный фермент - ревертаза, который обладает свойствами как РНК-зависимой, так и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Этот фермент при попадании вируса в клетку обеспечивает синтез одноцепочечной ДНК, а затем двуспиральной ДНК.
У вируса гепатита В генетический материал в виде двуспиральной ДНК, но реплицируется она иначе, чем описано в пункте 4. Сначала с ДНК транскрибируется +РНК, которая служит матрицей для синтеза белков и ДНК. Синтез ДНК осуществляется ревертазой по схеме, которая реализуется у ретровирусов.
Конкретные способы выражения генетической информации внутри упомянутых 7 групп вирусов также разнообразны. Синтез белков у одних происходит на индивидуальных мРНК, а у других - сначала образуется высокомолекулярный полипептид-предшественник, который потом разрезается на отдельные зрелые белки. Репликация генома одних вирусов происходит в клеточном ядре, другие всю свою жизнь проводят в цитоплазме. Надеюсь, Вы убедились, дорогой читатель, как поразительно разнообразие реализации генетической информации вирусов.
Глава 6. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
Репликация - это процесс воспроизведения ДНК, обеспечивающий передачу генетической информации из поколения в поколение и развитие многоклеточного организма из оплодотворенной яйцеклетки. На основании структуры ДНК, состоящей из двух комплементарных антипараллельных цепей, можно легко представить, что цепи при репликации расходятся, а потом каждая цепь служит матрицей, по которой синтезируется комплементарная ей цепь ДНК. В каждой дочерней клетке хромосомы состоят из одной двуспиральной молекулы ДНК, одна цепь которой является родительской, а другая - вновь синтезированной. Такой характер репликации получил название полуконсервативного (рис.14).
Рис.14. Полуконсервативный принцип репликации ДНК.
Рис.15. Схема репликации ДНК
Осуществляет репликацию фермент ДНК-полимераза, а его субстратами являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, полимеризующиеся на одной цепи ДНК (рис.15). Фермент наращивает цепь ДНК в направлении 5'- 3', при этом присоединение нового нуклеотидного остатка сопровождается гидролизом богатой энергией связи между первым и вторым фосфорными остатками в дезоксирибонуклеозидтрифосфате и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию энергетически выгодной. ДНК, имеющая огромные размеры, реплицируется с высокой скоростью - у бактерий 500 пар нуклеотидов в секунду, у человека - 50. При этом соблюдается высокая точность репликации. Так, у человека при репликации ДНК длиной 3 млрд. пар нуклеотидов возникает не больше трех ошибок. Это обеспечивается во многом работой самой ДНК-полимеразы, которая осуществляет коррекцию, дважды проверяя соответствие каждого нуклеотида матрице - перед включением его в состав цепи и перед тем, как присоединить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется только при условии, что последний включенный нуклеотид образовал правильную уотсон-криковскую пару с нуклеотидом матрицы. Если произошла ошибка, фермент перемещается в обратном направлении и вырезает неправильное звено.
ДНК-полимераза не может начать синтез на ДНК-матрице, а способна только добавлять новые нуклеотиды к уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Поэтому она нуждается в затравке. Роль затравки выполняет короткая последовательность РНК, синтезируемая из рибонуклеозидтрифосфатов ферментом, РНК-полимеразой (праймазой), который не обладает корректирующей активностью. В процессе репликации затравка удаляется, а бреши застраиваются ДНК-полимеразой с высокой точностью. Чтобы началась репликация, цепи ДНК должны разделиться хотя бы на время. Репликация начинается одновременно сразу в нескольких точках. Для этого используются специальные ферменты ДНК-геликазы. Используя энергию АТФ, они быстро движутся по одиночной цепи, разрывая водородные связи. Этот процесс начинается в точке начала репликации, которая называется репликационным глазком (рис.16)
Рис.16. Образование репликационной вилки и репликационного глазка.
Сайты инициации репликации имеют определенные последовательности ДНК. В геноме их может быть тысячи. Расплетенная ДНК образует репликационную вилку. В ней одиночные цепи связаны с особыми дестабилизирующими белками, не дающими цепям сомкнуться. При этом они не закрывают оснований ДНК, оставляя их доступными для спаривания. Чтобы репликационная вилка могла двигаться, неудвоенная скрученная часть ДНК должна вращаться. Это обеспечивают ферменты - топоизомеразы. Они вносят в цепь ДНК одно- и двухцепочечные разрывы, позволяющие цепям раскрутиться, а потом заделывают эти разрывы.
Отдельные белки, участвующие в репликации, объединены в крупный комплекс, включающий около 20 полипептидов и называющийся реплисомой. Репликация ДНК приурочена к фазе S клеточного цикла, которая у типичных эукариотических клеток длится около 8 часов. После окончания репликации каждая хромосома представлена двумя копиями ДНК, которые остаются связанными в области центромер до наступления митоза. Различные области хромосомы в S-фазе реплицируются в разное время. При этом активный хроматин реплицируется в ранней S-фазе, а высококонденсированный хроматин - в поздней. В митозе по одной копии ДНК оказывается в дочерних клетках.
Есть еще один принцип репликации. Дело в том, что новая цепь ДНК растет только в направлении 5'- 3'. Вспомнив, что цепи ДНК антипараллельны, легко представить, что только одну матричную цепь фермент может считывать непрерывно, на второй матричной цепи фермент, работая в том же направлении, считывает отдельные небольшие фрагменты длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. Эта цепь ДНК называется отстающей, в отличие от другой - ведущей, а фрагменты - в честь обнаружившего их ученого фрагментами Оказаки. После удаления РНК-овой затравки бреши застраиваются, как и на ведущей цепи. Удаление праймера на отстающей цепи приводит к укорочению 5'-конца дочерней цепи на размер первого праймера (10-20 нуклеотидов). При этом 3'-конец материнской цепи оказывается выступающим, он называется оверхенг (рис.17).
Укорочение хромосом в каждом цикле репликации примерно на 50 нуклеотидов происходит во всех соматических клетках организма. Однако это не приводит к нарушению функции хромосом. Это обусловлено тем, что на концах хромосомы существуют особые
Рис.17. Схема, иллюстрирующая возникновение 5'-недореплицированного конца
хромосомы и синтез теломерной ДНК с помощью теломеразы.
структуры - теломеры, образованные ДНК в комплексе с белками. Существование таких структур на концах хромосом было постулировано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Меллером. Лишенные теломер, хромосомы сливаются, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. В последние годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом, но и ответственны за прикрепление их к ядерной оболочке. Теломерная ДНК представлена многократно повторенными гексамерами TTAGGG, общая длина которых у человека может достигать 10 тысяч пар нуклеотидов. Поскольку теломерные последовательности ДНК не являются кодирующими, их укорочение в каждом раунде репликации лишь сокращает нетранскрибируемый текст теломеры. Тем не менее, это не проходит для клетки даром. Через определенное число делений концевая недорепликация приводит к дестабилизации генома, клетки впадают в состояние, называемое по-английски senescence - одряхление и затем погибают.
В 1961 году Леонард Хейфлик опубликовал результаты своей многолетней работы, свидетельствующей о том, что в культуре ткани, несмотря на обновление питательной среды, клетки делятся ограниченной число раз, что существует счетчик, считающий эти деления. После исчерпания этого предела (предел Хейфлика) клетки погибают. В 1967 году наш соотечественник, ныне здравствующий А. М. Оловников на основании общих представлений о механизмах репликации предположил, что при репликации линейной матрицы происходит ее недорепликация. Реплика всегда короче, чем матрица. Он высказал также гипотезу, что постепенное укорочение хромосом может лежать в основе ограниченного для каждого вида клеток потенциала деления, так называемого предела Хейфлика. Гипотеза Оловникова долгое время оставалась умозрительной, пока не был обнаружен и выделен фермент, который может реплицировать концы хромосом. Фермент назвали теломеразой. Теломераза - это РНК-содержащий белок, который осуществляет синтез ДНК по РНК-матрице, т.е. фермент обладает свойствами обратной транскриптазы. РНК в еге составе служит матрицей для синтеза теломерной ДНК, а белок катализирует этот процесс. Механизм действия теломеразы связан с повторным копированием , включающим этап элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды добавляются к 3'- концу цепи теломеры, и транслокацией фрагмента на конец новобразованной цепи (рис.18).
Гены теломеразы работают в половых, опухолевых клетках и в клетках иммортализированных (бессмертных) культур. Возникает вопрос, какова роль репрессии теломеразы в соматических клетках? Можно считать установленным, что репрессия теломеразы ответственна за старение клеток в культуре ткани (предел Хейфлика) и, возможно, имеет отношение к старению организма.
Рис.18. Этапы синтеза теломерного повтора теломеразой.
В 1998 году средства массовой информации сообщили о том, что американским ученым удалось преодолеть предел Хейфлика - вместо того, чтобы умереть, клетки человека в культуре ткани оставались юными, т.е. они потеряли способность стариться. Газеты откликнулись на это сообщение сенсационными заявлениями, что генетики нашли средство от старения, что таким образом достижимым представляется бессмертие. Действительно, ученым удалось заставить работать один из генов теломеразы в клетках, в которых он был молчащим. Открывает ли это путь к бессмертию?
Не все ясно в этом вопросе. На самом деле укорочение теломер, скорее всего, действительно является индикатором количества делений клеток. И только. Механизмы старения разнообразны. Например, у мышей теломера в 3 раза длиннее, чем у человека, но при этом они не живут дольше человека. В то же время получены мыши, у которых ген теломеразы нокаутирован, т.е. от не работает ни в каких клетках. Так вот у этих мышей наблюдаются признаки раннего старения, подобные тем, которые возникают у людей при прогерии Вернера (синдроме раннего старения) и продолжительность жизни животных оказалась сниженной на 25%. Однако из этих исследований вытекают важные выводы. Известно, что в злокачественных клетках теломераза активна, и это один из главных механизмов, обеспечивающих бессмертие опухолевых клеток. Следовательно, если избирательно ингибировать эту активность в опухолевых клетках, можно добиться торможения роста опухоли. В настоящее время это одно из направлений в терапии опухолей. Так, испытываются ингибиторы теломераз, ингибиторы теломеразной РНК, антисенс-терапия и т.д.
Итак, принципы репликации заключаются в следующем:
Комплементарность - каждая из двух цепей материнской молекулы ДНК служит матрицей для синтеза дополняющей ее, т.е. комплементарной дочерней цепи.
Полуконсервативность - в результате репликации образуются две двойные дочерние спирали, каждая из которых сохраняет в неизменном виде одну из цепей материнской ДНК.
Униполярность - ДНК-полимераза перемещается по матричным цепям в направлении от 3' к 5' -концам. При этом синтез комплементарных цепей всегда ведется от 5' к 3', т.е. униполярно.
Прерывистость - репликация начинается одновременно в нескольких местах молекулы ДНК. Участок между двумя точками, в которых начинается синтез дочерних цепей, называется репликоном. В каждом репликоне - репликационная вилка, которая перемещается вдоль молекулы ДНК. Одна цепь ДНК (лидирующая) реплицируется непрерывно, а другая (отстающая) прерывисто - в виде фрагментов по несколько сот нуклеотидов, фрагментов Оказаки.
Потребность в затравке - ДНК-полимераза не способна начать синтез ни лидирующей цепи, ни фрагментов Оказаки. Она может лишь наращивать уже имеющуюся полинуклеотидную цепь. Начальный концевой 5- участок - затравку, или праймер, размером до 20 нуклеотидов синтезирует особая форма РНК-полимеразы, называемая ДНК-праймазой.
Недорепликация ДНК - удаление праймеров, комплементарных 3'-концам ДНК приводит к укорочению ДНК в каждом цикле репликации.
Глава 7. РЕПАРАЦИЯ ДНК.
Последовательность оснований во вновь образованной цепи ДНК должна быть воспроизведена правильно, поскольку информация, которую она несет, необходима клетке и всему организму в течение всей жизни. Включение даже одного неправильного основания может привести к серьезным последствиям вплоть до летального исхода. Однако при огромном количестве нуклеотидов ДНК ошибки неизбежны. Механизм, с помощью которого ДНК-полимераза подбирает правильный нуклеотид к основанию матрицы, основан на том, что в соответствии с моделью Уотсона-Крика все пары комплементарных оснований имеют одинаковую геометрическую форму, отличную от любой другой пары оснований и это строго распознается ферментом. Образование водородных связей между правильными парами и между основаниями одной цепи также способствуют правильному выбору, поскольку это сопряжено с высвобождением энергии. Этот механизм имеет предел точности. ДНК-полимераза может совершать ошибки с частотой одно основание на 106 оснований. Это дало бы слишком большой уровень мутаций.
ДНК является объектом атаки многих физических и химических факторов. Они называются мутагенными. Репарация ДНК - это свойство восстанавливать повреждения, возникающие вследствие действия мутагенных факторов. Мутагенные факторы весьма разнообразны по своей природе и многочисленны. Это и физические, и химические, и биологические факторы. В клетке ДНК находится в виде полианиона и ее нативная структура сохраняется в виде двунитевой структуры только при существовании определенной концентрации катионов. Изменение этой концентрации также может оказывать сильный мутагенный эффект.
Одними из наиболее распространенных биологически активных веществ, влияющих на ДНК, являются ионы металлов, таких как медь, кадмий, ртуть. Даже при малых концентрациях они приводят к локальным повреждениям ДНК - распаду двойной спирали, одно- и двунитевым разрывам, что проявляется хромосомными аберрациями, точечными мутациями и другими нарушениями структуры и функции ДНК. Совместное действие ионов металлов и ионизирующих излучений приводит к резкому усилению (синергизму) их влияния на хромосомные перестройки. Это показали многие экспериментальные исследования, а также исследования животных и людей, оказавшихся в зоне катастрофы на Чернобыльской АЭС.
Другая группа биологически активных веществ - это органические молекулы, природного происхождения и синтетические. Их можно разделить на две подгруппы: 1) вещества, при взаимодействии с ДНК укладывающиеся в бороздки ДНК, взаимодействуя с фосфатными группами и атомами азотистых оснований; 2) вещества, встраивающиеся между плоскостями оснований. Их называют интеркаляторами. К первой группе относится ряд активных современных противомикробных и противоопухолевых лекарственных препаратов - дистамицин, нетропсин и др. Механизм их действия обусловлен ингибированием деятельности ферментов, обеспечивающих функционирование генетического аппарата микроорганизмов и опухолевых клеток. Ко второй группе относятся широко распространенные акридиновые красители, антрациклиновые антибиотики (адриамицин), краситель этидий бромид и противомалярийное средство - акрихин. Встраиваясь между соседними парами оснований ДНК, они деформируют двойную спираль ДНК, изменяя ее гибкость. Алкилирующие соединения (циклофосфан, алкеран, сарколизин и др.) осуществляют замену протонов, участвующих в водородных связях, на алкильные группировки - СН3 и С2Н5. Многие интеркаляторы являются хорошими люминофорами, т.е. светятся в определенном спектре лучей. Поэтому их используют для люминесцентного окрашивания ДНК in vivo. Избирательное связывание красителя с ДНК может быть обеспечено и ковалентным присоединением его к олигонуклеотиду, специфически связывающемуся с конкретным сайтом ДНК. Такие олигонуклеотиды называются антисмысловыми, или антисенс олигонуклеотидами. Использование их может повысить избирательность действия химиопрепарата. При этом гарантируется сохранение функции генома хозяина.
Спонтанные мутации, которые встречаются с частотой 1 на 109, очень быстро изменили бы нуклеотидные последовательности ДНК, если бы не было механизма репарации.
Открытие и детальное изучение процессов репарации ДНК, произошедшее сравнительно недавно, менее полувека назад, стало одним из интереснейших и важных достижений молекулярной биологии. В настоящее время описано много механизмов репарации. Одни более просты и происходят непосредственно после мутагенного воздействия, другие требуют синтеза новых ферментов и поэтому отсрочены во времени. Некоторые реакции идут до того, как клетка вступит в новую фазу деления; другие могут проходить и после того, как клетка закончит деление. Главный принцип репарации ДНК основан на том, что при изменении информации в одной цепи, во второй она сохраняется в неизмененном виде. В 1994 ферменты репарации были названы молекулами года.
Рассмотрим некоторые виды репарации. Репарация образования димеров пиримидиновых оснований. Двойная связь между пятым и шестым атомами углерода в составе пиримидиновых оснований ДНК может рваться под влиянием мутагенов, в частности ультрафиолетового света. В результате атомы остаются связанными одной связью, а при разрыве и этой связи образуются две свободные валентности. Они могут замкнуться с образованием димера пиримидинового основания. (рис.19). Для исправления димеризации существует фермент фотолиаза, который распознает димеры, присоединяется к ним и разрывает непозволительную связь. Фотолиаза активируется светом. Этот фермент есть у про- и нисших эукариот, у человека его нет.
Репарация О6 -алкилированного гуанина. Алкилирующие соединения, в частности, присоединяют метильную группировку к гуанину (Рис.20). В клетке есть метилтрансферазы, которые захватывают метильную группу от метилированного гуанина и восстанавливают структуру ДНК. Как правило, в клетке образуется достаточно молекул метилтрансфераз, чтобы обеспечить нужды репарации. В противном случае мутации такого рода не будут репарированы.
Рис.19. Образование димеров тимина.
Репарация АП-сайтов ( отсутствие пуринов или пиримидинов) за счет прямой вставки пуринов и пиримидинов. При некоторых типах повреждений ковалентная связь между сахаром и основанием (гликозидная связь) рвется, в результате чего в цепи образуется брешь. Исходный неповрежденный вид ДНК восстанавливают ферменты инсертазы.
Репарация однонитевых разрывов ДНК. Такой тип повреждений индуцируется ионизирующим облучением. В восстановлении повреждения участвуют ферменты полинуклеотидиллигазы, которые восстанавливают разорванные концы ДНК.
Рис.20. Метил-гуанин.
Эксцизионная репарация. Механизм ее подобен хирургическому вмешательству, когда поврежденные участки вырезаются, а образовавшиеся бреши восстанавливаются неповрежденным материалом. Это происходит за счет работы гликозилаз, которые узнают поврежденные основания ДНК, присоединяются к ним, разрывают гликозидные связи и образуют АП-сайты. Восстановление последних описано выше. Другим типом эксцизионной репарации является более сложная и энергетически более дорогая реакция вырезания значительного участка цепи ДНК перед и позади повреждения (рис. 21). Этот тип репарации осуществляется целым комплексом ферментов. Так, у человека вырезание поврежденного участка идет при совместной работе 17 ферментов, называемых эксинуклеазой, застройка бреши также требует участия нескольких ДНК-полимераз.
Репарация неспаренных оснований. Включенные в строящуюся цепь некомплементарные нуклеотиды называются мисмэтчами. Исправление такого рода нарушений осуществляет ДНК-полимераза. Двигаясь в направлении от 5'-конца синтезируемой цепи к 3'-концу, она может делать шаг назад и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду материнской цепи. В этом случае матричная цепь служит эталоном. Как фермент узнает, какую цепь надо исправить? В принятии решения ему помогает метилирование аденина в положении ГАТЦ в матричной, но не в дочерней цепи. В дочерней цепи до окончания репликации аденины еще не метилированы.
SOS- репарация. Что происходит, когда клетка подошла к моменту репликации ДНК, а ни одна из перечисленных репарационных систем не смогла устранить повреждение? Репликация застопорится при первом же встреченном нарушении и если их к клетке много, она обречена на гибель. В этих условиях в клетке активируется весьма рискованный механизм репликации. Индуцируется синтез ряда белков, которые соединяются с ДНК-полимеразой, "загрубляют" ее работу и такой подпорченный комплекс становится способным строить дочернюю цепь напротив подпорченной матричной цепи. Естественно при этом возникает много мутаций. Механизм удачно назвали SOS- репарацией, имея в виду аналогию с международно признанным сигналом бедствия (SOS- спасите наши души!). Клетка в результате спасается от гибели, ее ДНК оказывается удвоенной, хотя и с ошибками. Однако, если затронуты жизненно важные функции, она в дальнейшем все равно погибнет. Если же переживет, ее потомки навсегда будут нести последствия мутационной катастрофы.
Повреждение отдельных этапов репарации ведет к развитию наследственных заболеваний. У человека список таких болезней пополняется все новыми примерами.
<< Пред. стр. 2 (из 6) След. >>
Список литературы по разделу