<< Пред. стр. 5 (из 6) След. >>
Список литературы по разделу
Для использования в сельском хозяйстве получены штаммы трансгенных бактерий, которые наиболее эффективно осуществляют фиксацию азота, улучшают состояние почв, препятствуют образованию льда на корнях растений и т. д. Для целей охраны окружающей среды используют трансгенные бактерии, которые очищают почву и воду от фенолов, от загрязнения нефтью, ракетным топливом гептилом и др. загрязняющими веществами.
Ген фермента хитиназы встроили в бакуловирус (вирусы этой группы поражают только насекомых), последний используют в качестве биоинсектицида. Попадая в организм насекомых, он поражает их кишечник. Есть проект, предусматривающий введение гена хитиназы в растения.
12. 4. Трансгенные растения
По прогнозам к 2020 году население Земного шара достигнет 8 млрд человек. Питание и медицинское обслуживание такого количества людей является первостепенной задачей, стоящей перед человечеством. Растения являются основой питания людей. Кроме того, они еще по-видимому долго будут оставаться источником биологически активных и лекарственных препаратов. Следовательно, повышение урожайности сельскохозяйственных растений является главной проблемой современности.
30 лет назад завершилась Зеленая революция, в результате которой при использовании традиционных методов селекции ученые добились повышения урожайности сельскохозяйственных культур вдвое. Это было достигнуто за счет переноса в создаваемые сорта растений генов, отвечающих за развитие короткого и прочного стебля, за более эффективную утилизацию удобрений, за устойчивость к заболеваниям и вредителям и др. Идеолог Зеленой революции Норман Борлуаг в 1970 году награжден Нобелевской премией. Сохранение демографического роста не снимает с повестки дня проблему обеспечения населения продовольствием. Одно из ее решений заключается в создании трансгенных растений методами переноса генов не путем скрещиваний выбранных сортов, а непосредственным внесением в геном нужных генов.
Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно легко осуществима их регенерация in vitro из недифференцированных соматических клеток с получением нормальных фертильных растений. Это обусловлено тотипотентностью растительных клеток. Для конструирования генома растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, обеспечить включение его в наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать из единичных модифицированных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Для этого используют несколько методов трансгенеза.
Наиболее распространенный - это перенос генов с помощью Ti-плазмиды Agrobacterium tumifaciens, бактерий, которые поражают растения с образованием на корнях опухолеподобных разрастаний - корончатых галлов (Рис. 46). Эти бактерии обладают естественным механизмом горизонтального переноса генов, передавая свои плазмиды растительным клеткам. Это самый замечательный из известных примеров природной генетической инженерии. В природных популяциях Agrobacterium tumifaciens имеются плазмиды, содержащие опухолеродный генный сегмент. Встраивание его в клетку растения обусловливает развитие опухоли, которая синтезирует производные аргинина, отсутствующие у хозяина. Они необходимы для роста бактерий. Генные инженеры используют эти бактерии для трансгенеза. При этом из их плазмид вырезают гены, ответственные за образование корончатых галлов, и вносят нужные генетические конструкции. Однако этот метод эффективен только для двудольных растений, для однодольных, в основном злаковых, применяют баллистический метод - выстреливание из "генного ружья" золотых или вольфрамовых пулек, частиц величиной в 4мкм, покрытых ДНК, которую нужно перенести в клетку. Кроме того, применяют введение плазмидной ДНК в лишенные оболочки клетки растений (протопласты), электропорацию клеток, прокалывание клеток путем встряхивания их в суспензии микроигл, а также с помощью вирусной инфекции.
Вместе с нужным геном встраивают обычно и, так называемый, репортерный ген (ген устойчивости к канамицину), по которому судят, встроилась ли конструкция в клетку.
Постоянную угрозу для урожая сельскохозяйственных культур представляют сорняки. Для борьбы с ними применяют токсичные вещества - гербициды. Но при применении их страдают и культурные растения. Значит, надо сделать последние устойчивыми к гербицидам.
Рис. 46. Методы получения трансгенных растений.
Достигается это за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов или кодирующих нечувствительные к гербицидам белки-мишени. В настоящее время созданы такие растения устойчивые к гербицидам широкого спектра действия. Бельгийцы пытаются выйти на рынок с трансгенной капустой, устойчивой к гербицидам. Пока им это не удается, так как есть опасность, что она сама станет сорняком, с которым не справиться. Устойчивая к гербициду Roundup соя признана в США растением года в 1997 году.
Другая проблема, которая решается методами трансгенеза, это создание растений устойчивых к болезням - вирусным, бактериальным, грибковым, и к вредителям. Такие растения получены. Многие из них устойчивы к десятку вирусов.
Для создания устойчивости к вредителям генные инженеры использовали способность токсина B. turingiensis поражать насекомых. Токсин bt расщепляется в кишечнике насекомых и активизируется, после чего связывается с рецепторами клеток кишечника и вызывает их лизис. Для млекопитающих токсин B. turingiensis совершенно безвреден. Ген, отвечающий за синтез этого токсина, выделен, клонирован и перенесен в геном растений. Они оказались не поедаемыми насекомыми. В настоящее время трансгенные растения хлопка, кукурузы, картофеля с геном токсина bt уже производятся разными фирмами, и семена их продаются.
Новая генетическая информация может быть включена не только в ядерный геном растений, но и в пластиды. В результате в такой трансгенной клетке образуется до 1000 копий трансгена. Такие растения называются транспластосомиками.
Особое направление в трансгенезе растений связано с получение так называемых съедобных вакцин. Для этого в растения вводятся гены, кодирующие белки патогенных для человека бактерий и вирусов. Получены бананы и картофель, синтезирующие вакцины против холерного вибриона. Растения могут производить и белки животного типа. Удалось получить растения, в листьях которых содержатся антитела против стрептококка, вызывающего зубной кариес.
С помощью трансгенеза оказалось возможным управлять синтезом жирных кислот в растениях с целью повышения или снижения содержания ненасыщенных жирных кислот в растительном масле, а также получение белка, более сбалансированного по аминокислотному составу и легкоусвояемого млекопитающими.
Получение трансгенных растений превратилось в рутинную технологию для решения различных практических задач, которыми занимаются научные учреждения и коммерческие фирмы. В настоящее время у 120 видов растений получены трансгенные формы. Разрешены для использования в народном хозяйстве трансгенные виды: соя, кукуруза, картофель, томаты, хлопок, рапс, тыква, табак, папая, свекла. В растения введены гены устойчивости к гербицидам, к насекомым, к вирусам, к грибковым и бактериальным заболеваниям, гены, регулирующие созревание плодов и др. В Китае на многих тысячах гектаров произрастают растения с генами ризобактерий, фиксирующих азот. Пока не ясно, можно ли заменить использование азотистых удобрений таким способом.
Но главной задачей трансгенеза растений все-таки остается повышение продуктивности. Российскими учеными создано 20 видов трансгенных растений. Некоторые из них в настоящее время проходят испытания.
Перечень некоторых трансгенных растений
Растения с генами устойчивости к вирусным заболеваниям (табак с геном интерферона, томаты, кукуруза с генами устойчивости).
Растения с генами устойчивости к гербицидам "Баста" и "Облава".
Растения с генами устойчивости к вредителям, в основном с генами токсина B.turingiensis (картофель устойчивый к колорадскому жуку и фитофторе, кукуруза, хлопчатник).
Растения с генами нитрогеназы, фермента из азотфиксирующих бактерий, способные усваивать атмосферный азот.
Растения ? пищевые вакцины (картофель и бананы как вакцины против холеры), растения с генами антител против холеры и др. заболеваний.
Транспластомики ? растения, у которых трансген введен в пластиды (неординарная экспрессия гена до 10000 копий в клетке).
Растения с генами, обеспечивающими распад предшественника этилена, для предотвращения быстрой порчи (негниющие томаты, бананы свключенными в их геном генов, тормозящих синтез этилена,и др.).
Растения с генами лекарственных препаратов.
Синие розы, с геном пигмента, заимствованным у других растений.
12. 5. Трансгенные животные
Главным достижением генной инженерии является создание способов модификации геномов животных. Речь идет о направленном изменении структуры генов животного или введения в геном чужеродных натуральных и искусственных генов, т. е. о направленном конструировании новых геномов.
Основой этого подхода является введение клонированной ДНК с помощью микроинъекции в пронуклеус, обычно мужской, зиготы (Рис. 47) При этом экзогенная ДНК способна интегрироваться в геном и становиться его компонентом - трансгеном, следовательно наследоваться в поколениях. Для проведения этой процедуры оплодотворенные яйцеклетки выделяют из яйцевода животного и с использованием микроманипулятора вводят ДНК. На рис. 47 показана схема подобного эксперимента. Введенная таким способом экзогенная ДНК
Рис. 47. Получение трансгенных животных.
способна интегрироваться в геном реципиента случайным образом и зачастую в виде множества копий. Вследствие этого экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах, от полного ее отсутствия до уровня, превышающего экспрессию аутентичного гена. Тем не менее, этот метод активно используется как для получения как лабораторных, так и сельскохозяйственных трансгенных животных. Лабораторные трансгенные животные используются в основном для моделирования заболеваний человека. В настоящее время, благодаря трансгенной технологии, получено более 300 трансгенных линий мышей, моделирующих воспалительные, аутоиммунные, нейродегенеративные, онкологические и другие заболевания человека. Трансгенные сельскохозяйственные животные используются в основном как "фабрики" для наработки необходимых для человека биопрепаратов.
В последующем техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным вводить ДНК направленно, адресно в конкретную часть генома. Основой этой технологии послужило использование эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Известно, что ЭС-клетки сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длительном культивировании in vitro и, будучи вновь введенными в эмбрион, способны формировать химеры. Эта уникальная способность ЭС-клеток открыла широкие возможности для манипуляции с их генами. Адресное введение гена достигается благодаря возможности рекомбинации между экзогенной ДНК и ДНК реципиента. В результате этого происходит адресная инсерция гена в ДНК-мишень ЭС-клеток. После этого ЭС-клетки внедряют в бластоцисту животных на ранних стадиях развития (Рис. 48). В результате трансгенные эмбриональные стволовые клетки принимают участие в формировании тканей развивающегося плода, который представляет собой химеру. У химерных животных до 50% клеток составляют
Рис. 48. Получение трансгенных животных с помощью эмбоиональных стволовых клеток
клетки - потомки введенных трансгенных эмбриональных стволовых клеток. Показано, что они присутствуют во всех тканях, в том числе и зародышевом пути.
В эмбриональные стволовые клетки трансгены вводят с помощью ретровирусов, электропорации, липосом, в виде "голой " плазмидной ДНК, в виде искусственных конструкций на основе полисахаридов и др. К настоящему времени получено более 2000 трансгенных мышей, в геноме которых находятся различные введенные генетические конструкции. Получены трансгенные козы, овцы, свиньи, коровы и другие сельскохозяйственные животные.
Вводимая таким способом ДНК интегрируется в геном случайным образом и зачастую в виде множественных копий. Вследствие этого экспрессия трансгена у разных животных может сильно варьировать. Тем не менее этот метод активно используется для практических целей,например, для получения животных, которые являются поставщиками человеческих белков - факторов свертывания крови, гормонов и других необходимых для лечения человека белков. Дело в том, что трансгенные прокариоты, которых получать проще, не достаточно полно справляются с аналогичной задачей. Они не могут осуществлять посттрансляционную модификацию белков так, как это делают эукариотические клетки ( фолдинг, гликозилирование и др.). использование биореакторов, в которых продуцентами биопрепаратов являются культивируемые клетки животных, очень дорого. К тому же культивируемые клетки часто проявляют нестабильность генома. В связи с этим наиболее перспективной для получения белков человека является биотехнология с использованием трансгенных животных. Животные адекватным образом осуществляют посттрансляционные процессы и могут быть настоящими фабриками по производству любого белка. При этом можно сделать так, что нужный белок будет выделяться с молоком, что очень удобно в ряде случаев. Для этого трансген помещают под контроль одного из генов, контролирующих белки молока. Для промышленного биопроизводства используют коров, коз, овец и свиней. В настоящее время имеется реальная возможность производства в молоке трансгенных животных более 65 биологически активных белков человека. Так получают антитрипсин для лечения заболевания легких, антитромбин, необходимый для лечения инфаркта миокарда и инсульта, факторы свертывания крови для лечения гемофилии, С-реактивный белок для лечения иммунодефицитов, иммуномодуляторы, биостимуляторы, антитела и др.
Трансгенные животные находят применение для моделирования заболеваний человека. Введенный трансген обеспечивает экспрессию рецептора к соответствующему вирусу и, следовательно, возможность возникновения вирусной инфекции. Такой прием необходим в случае моделирования на животных вирусных инфекций, поражающих только человека.
В последние годы внимание исследователей привлечено к возможности модификации генома животных на уровне индивидуальных хромосом. Появились способы создания искусственных хромосом и подходы к переносу их от одного животного к другому. По сути, это новая биотехнология или генная инженерия. Она основана на модификации генома эмбриональных стволовых клеток. В Институте цитологии и генетики СО РАН О. Л. Серовым с сотрудниками используется оригинальный подход. Получают гибриды между эмбриональными стволовыми клетками и соматическими клетками. В полученных гибридах, только в тех из них, которые сохраняют плюрипотентные свой свойства и способны образовывать при введении в бластоцисту химеры, находятся единичные хромосомы от соматического партнера. Будучи введенными в бластоцисту мыши, они способны формировать химеры, а последние - продуцировать гаметы, идентичные по генотипу гибридным клеткам. Согласно этой схеме, возможен перенос индивидуальных хромосом от одного животного к другому. Не менее привлекательным выглядит сочетание метода с клонированием. В этом случае ядра полученных гибридов переносят в энуклеированную яйцеклетку. Значит, такие реконструированные ооциты обеспечат развитие особей с генотипом гибридной клетки.
Есть еще одна интересная модификации трансгенеза, позволяющая переносить большие количества генетического материала. В основе его - контролируемая фрагментация клеточного ядра, так что отдельные фрагменты содержат индивидуальные хромосомы или их фрагменты, их называют микроклетками. Последние сливают с эмбриональными стволовыми клетками. Полученные мыши-химеры (способом, описанным выше) называют транс-хромосомными. Недавно группа английских ученых получила серию транс-хромосомных мышей, несущих фрагменты 21 хромосомы человека. Важно, что у этих животных наблюдается тканеспецифическая регуляция экспрессии человеческих генов. Ученые научились также получать искусственные хромосомы и вводить их в геном животных. Уже получены такие мыши, которые могут использоваться для изучения роли отдельных структур в организации хромосом млекопитающих.
12.6. Клонирование
Новая страница в модификации геномов животных - это клонирование, основанное на переносе в энуклеированную яйцеклетку ядер соматических клеток, т. е. замене генома созревающей яйцеклетки на геном, взятый от другого животного. В комбинации с методами трансгенеза клонирование открывает фантастические возможности для генетической модификации геномов животных. Клонирование - это точное воспроизведение того или иного живого объекта в каком-то количестве копий. Бесполое размножение одной бактерии или амебы - это образование клонов соответствующих организмов.
Для генетиков растений получение клонов не составляет никаких проблем. Апомиксис - не что иное, как специфический способ размножения, позволяющий получать генетические копии материнского организма. Однако такая природой созданная технология в естественных условиях используется только некоторыми растениями (например, кукурузой). Для многих сельскохозяйственных растений характерен половой способ размножения. Но и для них метод клонирования разработан давно. Если любую растительную клетку лишить прочной оболочки, а потом обработать ростовыми факторами, она начинает делиться, образуя колонии клеток, каллус, из которых каждая может дать начало целому растению. Для селекционеров эта технология представляет большой практический интерес, так как дает возможность вводить определенные гены в клетки каллуса и в последствии получать серию растений, модифицированных по желанию экспериментатора.
Генетики животных получают клоны, если животные размножаются партеногенезом, то есть бесполым путем, без предшествующего оплодотворения. Получают клоны и в экспериментальной эмбриологии. Если зародыш морского ежа на ранней стадии дробления разделить на составляющие его клетки - бластомеры, то из каждого бластомера разовьется целый организм. У человека известны случаи своеобразного естественного клонирования. Это, так называемые, однояйцевые близнецы, которые возникают сравнительно редко из-за разделения оплодотворенной яйцеклетки на два бластомера, каждый из которых потом развивается самостоятельно. Такие близнецы очень похожи друг на друга.
В настоящее время предприняты попытки (и они увенчались успехом!) клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки.
История клонирования животных началась с исследований российского ученого Г. В. Лопашова в 40-х годах, который разработал метод пересадки ядер в яйцеклетку лягушки. Однако из-за беспредельного господства в отечественной биологии печально известной лысенковщины, объявившей генетику лженаукой, статья Г. В. Лопашова не была опубликована, а в 50-е годы американские эмбриологи Бригс и Кинг выполнили сходные эксперименты и приоритет достался им, как это часто случалось в истории Российской науки. В дальнейшем Джон Гердон из Великобритании усовершенствовал эту методику и стал удалять ядра из яйцеклеток лягушки и вводить вместо них ядра разных дифференцированных соматических клеток, в частности из эпителия кишечника и плавательной перепонки. В результате развития такие модифицированные яйцеклетки превращались во взрослые особи, точные копии лягушки, от которой взяты ядра соматических клеток (рис. 49). Вслед за этими работами Карл Иллмензее опубликовал сообщение о том, что ему удалось получить клон из трех мышат. К сожалению, из-за того, что никому из экспериментаторов не удалось воспроизвести эти эксперименты, опыты Иллмензее признали недостоверными, и на некоторое время в этой области исследований воцарилось спокойствие. И вдруг как гром среди ясного неба в феврале 1997 года появилось сообщение, что в лаборатории Яна Вильмута из Рослинского института (Эдинбург, Шотландия) разработан эффективный метод клонирования млекопитающих и на его основе создана овечка Долли. Схема эксперимента представлена на рисунке 50.
Ооциты были извлечены из овец породы Шотландская черномордая и помещены в культуральную среду, после чего на них проведена операция энуклеации - удаления клеточного
Рис. 49. Схема получения клонированных лягушек
ядра. Ядро соматической клетки взяли для трансплантации из молочной железы лактирующей овцы породы Финский дорсет и слили с энуклеированной яйцеклеткой. После этого модифицированную яйцеклетку активировали к делению электрическим током и после культивирования в питательной среде в течение 6 дней трансплантировали в матку овцы - суррогатной матери. Получается, что у Долли 3 матери - одна, которая дала свой генетический материал, вторая - от которой взяли яйцеклетку (кстати, митохондрии у Долли от Рис. 50. Схема получения овечки Долли
этой овцы) и третья - которая вынашивала ягненка, и ни одного отца. Из 236 опытов успешным оказался один, в результате которого и родилась овечка Долли. Вслед за этим был получен клон мышей группой ученых из Гонолуллу под руководством Риузо Янагимачи.
Эти работы, безусловно, являются выдающимся достижением молекулярной генетики. Можно сказать, что техническая задача получения клонированных животных решена.
Появление Долли вызвало немедленную реакцию во всех странах. Общественность взволнована вопросом, допустимо ли распространить метод клонирования на человека? Правительства многих стран наложили мораторий на клонирование человека. Однако запретить эти эксперименты вряд ли удастся. Нет ничего, что было бы недоступно в этой технологии для современной эмбриологической лаборатории. Американские ученые получили клонированных обезьян, а это уже очень близко к человеку. Однако есть надежда на то, что сама природа поставит заслон этим исследованиям на человеке. Нельзя сказать, что яйцеклетка человека больше похожа на яйцеклетку овцы, чем сам человек на овцу. Различия большие. Однако теоретически клонирование человека возможно. Только вряд ли нужно. Хочется думать, что человечество воздержится от таких рискованных экспериментов.
В теоретическом плане работа Яна Вильмута показала, что в процессе развития геном не претерпевает необратимых изменений и возможно репрограммирование генома соматических клеток путем трансплантацию их в цитоплазму ооцита. В связи с этим клонирование млекопитающих открывает возможность выращивания ткани для пересадки пациентам с тяжелыми неизлечимыми заболеваниями, то есть создание банков здоровых тканей.
Глава 13. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ
Успехи трансгенеза обусловили возникновение нового комплекса методов лечения заболеваний - генную терапию, основанную на введении в организм генетических конструкций с целью лечения заболеваний путем направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. В арсенале генной терапии несколько приемов. Один из них используется в тех случаях, когда утрачена функция какого-либо гена и для лечения эту функцию нужно восстановить. Наиболее подходят для такого способа лечения заболевания, которые обусловлены дефектом одного гены, особенно если этот ген выделен и клонирован. В этом случае введение в организм нормального гена при его экспрессии обеспечит недостающий продукт (позитивная генная терапия).
Второй подход связан с необходимостью подавления функции "больного " гена или избыточно экспрессирующегося гена. Этот прием называется генный нокаут. Для решения этой задачи применяют ряд методов. Во-первых перенос гена, кодирующего антисмысловую мРНК ( антисенс-мРНК), т. е. мРНК, комплементарную той, которая кодирует мРНК "больного " гена, в результате трансляция последней подавляется. Такой подход называется негативной генной терапией, или антисенс-терапией. Для избавления от ненужного генного продукта используют также метод, который называется внутриклеточной иммунизацией. Он заключается в том, что в клетку вводят ген, кодирующий антитело к нежелательному белку, при экспресси гена такие антитела будут связывать специфически образующийся белок и отменять его функцию. Такие внутриклеточные антитела получили название интрабоди. Их применение облегчилось замечательной находкой. Известно, что за связывание с антигеном отвечает не вся сложная молекула антитела, состоящая как минимум из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей (может быть и больше), а только вариабельные домены каждой из них. Вот и сделали конструкцию, кодирующую эти два домена, так называемые одноцепочечные антитела. К этой конструкции можно присоединить сигнальные последовательности, которые будут направлять ее в определенные компартменты клетки, к определенным клеточным структурам. Таким образом, внутриклеточные антитела открывают универсальный способ воздействия внутри клетки на любые продукты синтеза. Например, подобная работа проведена с ?- субъединицей рецептора интерлейкина-2. Экспрессия этого рецептора в значительной степени повышена при некоторых формах лейкемии. Внутриклеточные антитела в данном случае обусловили отсутствие рецептора на поверхности клеток и обусловили тем самым лечебный эффект. Еще один прием для подавления функции гена связан с введением генетической конструкции, кодирующей рибозим, т. е. РНК, обладающую ферментативными свойствами и специфически расщепляющую соответствующую вредную мРНК что как нетрудно догадаться, приведет к отмене ее трансляции и наработки белка.
Третий подход - это корригирующая генная терапия, т.е. исправление структуры и, следовательно, функции испорченного гена.
Иногда как отдельный способ генной терапии выделяют модификацию генетическим путем клеток для усиления иммунного ответа. В этом случае гены вводят либо в клетки, против которых вследствие их модификации развивается иммунный ответ (усиление иммунитета на опухолевые клетки ), либо в клетки иммунной системы ( для коррекции функции иммунной системы при иммунодефицитах).
В число заболеваний, подлежащих генной терапии, входят, прежде всего, наследственные болезни, и среди них те, которые обусловлены рецессивной мутацией и являются моногенными. В настоящее время известно более 4500 заболеваний, относящихся к генетическим, т. е. в основе их патогенеза лежит повреждение генов. Но и такие болезни, как рак, атеросклероз, нейропсихические заболевания, диабет и другие, также могут быть объектами генной терапии. Стоит заметить, что если речь идет о человеке, то подразумевается только соматическая генная терапия, т. е. введение генов в соматические, а не зародышевые клетки.
Во всех случаях генной терапии чаще всего используют метод ex vivo (рис. 51), заключающийся в том, что клетки, взятые из организма пациента, подвергают трансгенезу in vitro, отбирают трансфецированные клетки и возвращают обратно.
Рис. 51. Генотерапия способом ex vivo.
Какую бы стратегию генной терапии ученые ни использовали, необходимо решить в каждом случае ряд практических вопросов, которые решаются в принципе также как и при получении трансгенных животных, а именно: как сделать и как доставить необходимую генную конструкцию, как обеспечить экспрессию гена и ее регуляцию в организме. Процесс генокоррекции начинается с создания полноценно работающей генетической конструкции, содержащей кодирующую и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени.
По выражению Индера Вермы из Института им. Солка в США, в генной терапии есть три основных проблемы - это проблема доставки, доставки и доставки.
Векторы для доставки генетических конструкций по назначению делят на вирусные и невирусные. В вирусных векторах рекомбинантная ДНК, несущая экспрессируемый ген, упакована в геном ретровируса, аденовируса, герпес-вируса и т. д. При этом из вирусного генома удаляют ту его часть, которая ответственна за формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток, но сохряняют те гены, которые отвечают за перенос и экспрессию клонированного гена. До последнего времени главное место среди вирусных векторов занимали ретровирусы (РНК-содержащие вирусы). Ретровирусы обладают такими свойствами, как будто они специально созданы для переноса генов: для репликации они должны внедриться в геном клетки-хозяина, стабильно в нем реплицируются, и передаются подобно клеточным генам в поколениях клеток. При этом ретровирусы позволяют включать в состав их генома чужеродные гены, без утраты способности к репликации. Проникновение модифицированного ретровируса в клетку индуцируется его присоединением к соответствующему рецептору. Это делает возможным переносить гены в вирусном векторе в определенный тип клеток. Правда, эти клетки должны быть делящимися, потому что ретровирусы не могут проникать через ядерную мембрану и только при ее лизисе (что происходит при делении клеток) оказываются способными внедриться в геном хозяина.
Аденовирусные векторы создаются на основе ДНК-содержащих вирусов, вызывающих у человека заболевания верхних дыхательных путей и желудочнокишечного тракта. Они обладают широкой видовой и тканевой специфичностью, заражают клетки на любой стадии клеточного цикла, способны заражать клетки нервной системы, мышечной ткани, иммунной системы. В подавляющем большинстве случаев они не интегрируются в геном, а находятся в клетке в форме эписом. В качестве векторов используют также вирусы герпеса, осповакцины, лентивирусы и др.
Вирусные векторы эффективно доставляют генетические конструкции в клетки, однако у них много недостатков. Ретровирусы проникают, как уже было сказано, только в делящиеся клетки, внедряются в геном хозяина, что чревато инсерционным мутагенезом и активацией онкогенов или инактивацией антионкогенов и, как следствие, риском развития опухолей. Аденовирусы не внедряются в геном, что является их преимуществом, но эпихромосомная их локализация не обеспечивает длительной экспрессии трансгена. Поэтому такие рекомбинантные вирусы надо вводить повторно. А это вызывает развитие иммунологических реакций. В 1999 году все молекулярные биологи (и не только они) были потрясены трагическим случаем с пациентом, лечившимся в США методом генной терапии. Ему вводили аденовирус с геном орнитилкарбомоилтрансферазы, по которому у него был дефицит. После 4-й инъекции пациент погиб. Вскрытие показало атрофию всех внутренних органов за счет гибели клеток по типу апоптоза.
Недостатки вирусных векторов заставляют генных инженеров изыскивать другие способы доставки генетических конструкций. Так появились невирусные векторы. Арсенал их довольно разнообразен - это "голая " плазмидная ДНК, катионные липосомы, искусственные макромолекулы, состоящие из углеводных адресных групп и сигнальных последовательностей, обеспечивающих поступление в клетки, введение генов в искусственных хромосомах, и др. Перечисленные векторы пытаются ввести так, чтобы обеспечить целевую доставку в клетки, где они будут экспрессироваться. Среди способов направленного введения векторов наиболее распространены следующие. Введение непосредственно в ткань (кожа, мышцы, тимус), введение в специальном баллончике непосредственно в сосуд для лечения ишемической болезни сердца, введение в виде аэрозолей для лечения болезней легких и т. д. Однако все перечисленные векторы и способы их введения имеют один главный недостаток - встраивание переносимой генетической информации происходит случайным образом. В идеале введение гена должно быть прицельным, т. е. сайт-специфическим, для замещения испорченного гена. С этой целью в настоящее время начинает применяться метод химеропластики. Делают шпильку - дуплекс, состоящий из комплементарных нуклеотидов ДНК и РНК. Ветви шпильки комплементарны участкам испорченного гена, а в петле, нуклеотид, который нужно заменить. Такие химеропласты доставляют в клетки (чаще всего в эмбриональные стволовые) с помощью липосом. В конструкции обязательно присутствует бактериальная рекомбиназа. Таким способом удается исправить до 40% клеток. Другой способ исправления гена основан на исключении экзона, в котором находится мутация. В некоторых случаях удаление из первичного транскрипта, содержащего стоп-кодон, но несущественного для функции белка, спасает ситуацию. Белок синтезируется, правда без соответствующего домена, и может выполнять основную функцию и при этой утрате. Для исключения экзона в клетки вводят короткие антисенс РНК, комплементарные участкам сплайсинга, чтобы экзон оказался сплайсированным.
В последнее время особое внимание исследователей уделяется созданию векторов на основе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию в них основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные гены и их регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена в нужной ткани и в должное время.
13.1 Успехи генной терапии
Наиблее успешна генная терапия при лечении наследственных дефектов метаболизма. Генно-терапевтическая стратегия облегчается в данных случаях тем, что для нормального существования организма необязателен 100 % уровень отсутствующего у больного фермента. Например, гемофилия В, развивается от недостаточности фактора свертывания крови IX, когда уровень его менее 1% от нормы. Если же этот уровень удается увеличить до 1-10%, больные чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому в этих случаях легче осуществить заместительную терапию.
Первое успешное применение генной терапии связано с лечение ТКИД - тяжелого комбинированного иммунодефицита, обусловленного недостаточностью фермента аденозиндезаминазы (АДА). В сентябре 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим заболеванием были пересажены ее собственные клетки - лимфоциты, в которые с помощью ретровируса был введен ген АДА. В результате наблюдалось улучшение состояния пациентки. Столь же успешным было лечение и другой такой же пациентки.
Другой пример лечения заболевания из этой же группы болезней - наследственной гиперхолистеринемии. Дефект находится в гене, кодирующем рецептор липопротеинов низкой плотности. Следствие этого - гиперхолестеринемия, ранний атеросклероз, инфаркты миокарда. Для лечения у пациента провели частичное удаление ткани печени и в печеночные клетки с помощью ретровируса ввели генетическую конструкцию, содержащую ген нормального рецептора. Через воротную вену трансгенные клетки возвращены пациенту. Наблюдалось восстановление экспрессии рецептора. Это очень важный результат. Он показывает некую общую идею использования клеток печени для трансгенеза в виду ее особого значения для функционирования организма. Не зря наши предки считали печень (а не мозг) местом жизненной силы и управительницей эмоций. Клетки печени, которые синтезируют много важных белков, могут быть использованы для вставки генов, компенсирующих наследственные дефекты. Аналогично лечению наследственной гиперхолистеринемии, лечат гемофилию В. А вот с гемофилией А, болезнью королей и царей, дела обстоят сложнее из-за большого размера гена фактора свертывания крови VIII. Это препятствует встраиванию его в вирусный вектор. Но оказалось, что можно использовать укороченный ген. Тогда он кодирует белок без одного несущественного для проявления функции домена и обеспечивает терапевтический уровень фактора.
В эксперименте достаточно хорошо разработаны молекулярно-генетические подходы к лечению миодистрофии Дюшенна (МДД). Это одно из частых наследственных заболеваний человека (1: 5000). Причиной его является мутация в гене дистрофина, структурного белка сарколеммы. Ген дистрофина - самый большой в геноме человека. Он содержит 85 экзонов и занимает 0,1 % ДНК клетки. Его молекулярная масса составляет 427 кD. Мутация в гене проявляется дегенерацией мышечных волокон скелетной мускулатуры, диафрагмы и сердца. Разработаны следующие приемы генной терапии МДД:
Введение в мышцу в аденовирусном или ретровирусном векторе мини-гена дистрофина, который способен восстанавливать нормальный мышечный фенотип
Невирусные способы доставки полноразмерного гена дистрофина прямой инъекцией, баллистической трансфекцией, в составе липосом и полимерных носителей
Химеропластика, или генная хирургия, заключающаяся в трансфекции гибридными ДНК/РНК молекулами шпилечной структуры с нужным основанием, по которому планируется замена
Исключение экзона путем трансфекции короткими антисмысловыми РНК, комплементарными сайтам сплайсинга первичного транскрипта, Это приводит к выбрасыванию экзона, несущего мутацию. При этом восстанавливается рамка считывания и образуется усеченный белок, способный выполнять функцию
Дерепрессия аутосомного гомолога дистрофина - гена утрофина, продукт которго может компенсировать недостаток дистрофина
Список наследственных заболеваний, находящихся на разных стадиях реализации метода генной терапии, пополняется с каждым годом. Он включает, помимо указанных выше, муковисцедоз, мышечную миодистрофию Дюшенна, фенилкетонурию, болезнь Гоше и др. Генной терапии подлежат и многие приобретенные заболевания. Среди них инфекционные болезни и злокачественные опухоли, хорея Геттингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др. К настоящему времени в мире более 3000 человек имеют в своем организме трансгенные клетки, введенные с целью лечения. Среди 396 одобренных для клинических испытаний протоколов геннотерапевтических проектов 60% направлены на лечение опухолей, 15% - инфекционных заболеваний, 15% наследственных заболеваний и 10% - прочих.
Глава 14. РИСК ГЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ. ОПАСНОСТЬ МНИМАЯ И РЕАЛЬНАЯ.
Развитие генной инженерии и ее достижения создают впечатление, что человек может властвовать над генами, в том числе и над собственным геномом. В связи с этим в общественной среде появились опасения относительно использования новых генных технологий. Не окажутся ли опасными для человека организмы, созданные с помощью этих технологий? Не вызовут ли трансгенные микроорганизмы эпидемии ранее неизвестных заболеваний? Не нарушат ли они экологическое равновесие? Не произойдет ли горизонтальный перенос генов устойчивости к болезням и вредителям от трансгенных культурных растений к сорнякам? Не увеличится ли в результате применения генной терапии число людей гомозиготных по вредным генам? Не встанет ли в результате этого человек на "генные костыли"? Оправданы ли эти процедуры на фоне грядущего перенаселения? Нет ли опасности создания биологического оружия на основе трансгенных вирусов и бактерий? Не представит ли это угрозу всему человечеству? Хорошо ли, что создает новые организмы и наполняет ими сушу и море человек, существо, как показывает опыт, неразумное и непредусмотрительное? Не открывают ли генные технологии путь к клонированию человека по злому или доброму умыслу? Не означает ли последнее возврат к евгенике - улучшению породы человека? Вот неполный перечень возникающих вопросов. По всем этим вопросам проходят активные дискуссии в прессе и по телевидению. Обсуждаются преимущества генных биотехнологий и их возможный риск. Вывод напрашивается очевидный - остановить развитие генных технологий нельзя, но надо всерьез заняться обеспечением их биологической безопасности.
Опасность, связанная с введением в обиход трансгенных растений, скорее всего, мнимая. Серьезных аргументов против использования трансгенных растений нет. Традиционные методы селекции, например, гибридизация, не вызывающие ни у кого опасений, ведут к рекомбинации огромного числа генов и возникновению самых разнообразных генотипов. В противоположность этому, генные инженеру вносят в геном растения 1-2 гена. По сути дела, это та же селекция, только направленная и прицельная. Это касается всех генов, в том числе и обусловливающих резистентность к болезням и вредителям. В естественных условиях тоже происходит их перенос в разные растения, так что новые биотехнологии ничего сверхестественного не делают. Однако нельзя исключить опасность утечки трансгенов к другим растениям - сородичам через спонтанную гибридизацию. Например, если гены гербицидоустойчивости окажутся в геноме сорняков. Вместе с появлением растений, устойчивых к болезням и вредителям, происходит коэволюция возбудителей болезней и насекомых-вредителей. В результате естественным отбором будут отбираться среди них более устойчивые к используемым против них ядам.
Более всего общественность озабочена введением в окружающую среду трансгенных микроорганизмов. Однако Федерация Европейских микробиологических обществ (ФЕМО) констатирует, что широкомасштабная в течение более 20 лет генная инженерия не дала ни одного примера повышения вирулентности и патогенности трансгенных форм по сравнению с исходными. А вот, как утверждают эксперты, повысить устойчивость к антибиотикам легко. Но надо быть справедливыми, в естественных условиях и без применения генных технологий этот процесс происходит в результате генных мутаций и переноса генетического материала между бактериями. Именно поэтому многие болезнетворные бактерии оказываются резистентными к применяемым для лечения антибиотикам. Для вируса гриппа, в большей степени, для вируса иммунодефицита человека характерным является процесс образования новых антигенных вариантов, что позволяет им ускользать от иммунного ответа. Эксперты ФЕМО на основе многолетних наблюдений пришли к выводу - не зарегистрировано ни одного случая опасного распространения в окружающей среде рекомбинантных организмов. Очевидно, что вводимые в окружающую среду трансгенные микроорганизмы будут подвержены всем типам мутационных процессов и смогут участвовать во всех видах генетического переноса, то есть в эволюции. Последствия этого процесса непредсказуемы и могут быть самыми неожиданными.
Да, следует согласиться с тем, что на основе трансгенеза относительно легко создать биологическое оружие. В этой ситуации стоит уповать только на человеческий разум, контроль со стороны международных организаций, а также на борьбу с терроризмом.
Разумеется, необходима разработка разумных, адекватных и гибких правил безопасности генных технологий. Уже сейчас есть документы, регламентирующие применение генных технологий. Это директивы, касающиеся правил безопасности работы в лабораториях, промышленности и правила внесения генетически модифицированных организмов в окружающую среду. В большинстве стран эти директивы включены в свод национальных законов. А это, согласитесь, не мало.
Во многих странах принят мораторий на работы с яйцеклетками и эмбрионами человека, а также полный запрет на клонирование человека. Начата разработка специальных законов, ограничивающих применение генных технологий. Совет Европы вынужден был принять дополнительный протокол к Конвенции" О правах человека и биомедицине", где говорится, что "инструментализация человеческих существ путем намеренного создания генетически идентичных человеческих существ несовместима с достоинством человека и таким образом представляет собой злоупотребление биологией и медициной".
Нельзя не заметить, что в последнее время принцип безусловного запрещения введения генетических конструкций в половые клетки начинает приобретать менее категоричный характер, чем несколько лет назад. Так, в мае 2001 года появилось сенсационное сообщение о рождении в США генетически модифицированных детей. Речь идет об использовании генетического метода, позволяющего преодолеть врожденное бесплодие, обусловленное дефектом митохондрий. Коллектив ученых во главе с Д. Коэном в институте репродуктивной медицины в штате Нью-Джерси разработал и применил технику переноса цитоплазмы из ооцита. Оплодотворение яйцеклетки женщины, страдающей бесплодием, проводят in vitro и тончайшей пипеткой в оплодотворенную яйцеклетку вводят капельку цитоплазмы из яйцеклетки здоровой женщины. Перенесенные с ней митохондрии приживаются и обеспечивают нормальное развитие плода. С 1997 года такая операция выполнена на 30 страдающих этой формой бесплодия женщинах. 12 из них родили детей, причем у трех были двойни. Все полученные таким путем дети здоровы. Перенос митохондрий - цитодукция - в клетки различных организмов проводится давно. В данном случае - это вмешательство в зародышевый путь. Девочки передадут митохондрии своим потомкам, вместе со всеми изменениями в их ДНК. Избавление женщин от бесплодия, бесспорно благородная задача, однако надо отдавать себе отчет в том, что это манипуляции с яйцеклетками человека. Они, выходит, допустимы?
В Институте репродуктивной генетики в Чикаго группой исследователей под руководством Ю. Верлинского на людях опробован, так называемый, метод предимплантационной диагностики. Он заключается в следующем. Оплодотворение производят in vitro. Когда зародыш достигает стадии 8 клеток, одну без ущерба для дальнейшего его развития удаляют и подвергают диагностике. Они обеспечили рождение здорового ребенка после оплодотворения спермой мужчины, гетерозиготного по мутации в гене Р53. Из нескольких зародышей был отобран тот, который не содержал этой мутации, и был имплантирован в матку. Этот метод является альтернативой пренатальной диагностике, когда устанавливается генотип развивающегося в матке эмбриона и в необходимых случаях проводят абортирование. При распространенном осуждении абортов метод предимплантационной диагностики представляется предпочтительным. Используя этот метод, можно по заказу сделать донора, например, клеток костного мозга. Есть сообщение, что в указанном выше Институте в 2000 году появился на свет путем отбора эмбрионов ребенок, который стал донором костного мозга и спас жизнь своей старшей сестре. Вообще, техника оплодотворения человеческой яйцеклетки в пробирке была разработана в Англии еще в 1978 году. В настоящее время она обогащена тестированием и отбором эмбрионов. По сути здесь нет вмешательства в геном.
В отношении человека применяют также, так называемое, терапевтическое клонирование. В отличие от репродуктивного клонирования, которое применяют для производства клонированных животных, терапевтическое клонирование не сопровождается имплантацией зародыша в матку, а он используется лишь для получения эмбриональных стволовых клеток человека. Далее полученные эмбриональные стволовые клетки можно использовать для дифференцировки в определенном направлении с целью использования для "ремонта" больного органа.
Что касается репродуктивного клонирования человека, то возможность его, безусловно, существует. Однако из-за массы морально-этических возражений во многих странах, в том числе и в России, введен мораторий на эти работы. Главное возражение - технически процедура клонирования недостаточно отработана и может привести к появлению физически и психически неполноценных детей. Это недопустимо! Кто будет нести за это ответственность?
Задумывались ли Вы, дорогой читатель, почему не менее выдающиеся достижения биологии и медицины в предшествующее время (изобретение шприца, рентгена, антибиотиков, вакцинации и др.) не сопровождались разработкой этико-правовых документов, регулирующих их применение? Очевидно потому, что они не противоречили традиционным моральным принципам, чего нельзя сказать о некоторых генных технологиях.
Глава 15. ГОМЕОСТАЗ
Все организмы представляют собой открытые системы, активно обменивающиеся с окружающей средой различными веществами и информацией и сохраняющие постоянство своей внутренней среды - гомеостаз. Вещества, с которыми соприкасается организм, могут использоваться как пищевой ресурс для пополнения энергии, а также как сигналы, например, различные феромоны, для получения соответствующей информации.
Однако немало веществ, оказывающих вредное влияние на организм. Они должны быть обезврежены и выведены.
Низкомолекулярные соединения, растворимые в воде, обезвреживаются в печени и выводятся почками. Другая группа веществ - это нерастворимые в воде, но растворимые в жирах вещества. К ним относятся многие лекарственные препараты, пестициды, гербициды и другие, объединяемые одним термином - ксенобиотики. Они накапливаются в углеводородном слое мембран, в вакуолях жировых клеток и не выводятся с мочой. В обезвреживании таких веществ принимает участие система, включающая до 30 ферментов. Главную роль в ней играют ферменты семейства цитохрома Р450 печени, находящиеся в клетках на внутренней стороне мембран эндоплазматического ретикулума. После попадания ксенобиотика в печени многократно увеличивается поверхность эндоплазматического ретикулума и синтез Р450. В результате метаболизма ксенобиотики становятся растворимыми и выводятся из организма. Однако некоторые соединения после биотрансформации становятся более токсичными из-за образования высокореактивных промежуточных продуктов, которые необратимо связываются с белками, модифицируя их. Такой процесс происходит с канцерогенными веществами, которые для проявления эффекта нуждаются в метаболической активации. Есть еще один механизм защиты от ксенобиотиков - Р-гликопротеин. Он находится в плазматической мембране многих клеток. Он удаляет гидрофобные вещества из клетки за счет гидролиза АТФ. В круг удаляемых Р-гликопротеином веществ попадают многие лекарственные препараты, в частности противоопухолевые соединения. Поэтому при всей ее полезности эта система мощным препятствием для лечения заболеваний.
Многие реакционно активные вещества могут образовывать комплексы с белками. Их называют конъюгировнными антигенами. Они индуцируют у позвоночных развитие иммунологических реакций, прежде всего синтез антител и развитие иммунологической памяти. Эти представления основаны на работах дважды нобелевского лауреата Карла Ландштейнера. Он установил, что иммунитет может развиваться не только против вирусов, бактерий и чужеродных клеток, но и против простых химических веществ. Однако последнее происходит только в том случае, если эти вещества химически связаны с белками. Он назвал их гаптенами (прищепками), а комплекс с белком - конъюгированным антигеном. При повторном попадании этого же вещества, оно связывается с антителами. Антитело, таким образом, можно представить как пептидный аналог непептидного ксенобиотика, закодированное обратным кодом. Оказывается, в организме может существовать и прямой двойник ксенобиотика, только в пептидной форме. Это ничто иное, как антиидиотипическое антитело, т.е. антитело против активного центра антитела, связывающего ксенобиотик. Существование таких антител, несущих внутренний образ антигена, постулировано всемирно известным иммунологом Нильсом Ерне, а в последствии подтверждено экспериментально. В настоящее время антиидиотипические антитела получены на разные структуры патогенов, они используются в качестве вакцин. В отличие от живых ослабленных вакцин, такие вакцины совершенно безвредны и обладают рядом других преимуществ. Из всего вышесказанногоо следует удивительный вывод - в организме в виде белков-иммуноглобулинов существует параллельная сеть веществ, с которыми он встречается в своей жизни. Такие аналоги ксенобиотиков имитирут нередко и биологическую активность вещества, связываясь с соответствующими рецепторами. Все это позволяет говорить об активно работающей в организме позвоночных иммунохимической системе гомеостаза.
С крупными чужеродными макромолекулами, а также целыми клетками и патогенами, включая вирусы и бактерии, справляется защитная система, которая называется иммунитетом. Иммунитет обеспечивается двумя системами - неспецифической, или врожденным иммунитетом, и специфической, или приобретенным иммунитетом. Обе системы, используя разные принципы защиты, тесно связаны друг с другом, так что могут рассматриваться как стадии одного и того же процесса. Неспецифический иммунитет выступает как первая линия защиты и как заключительная ее стадия, а система приобретенного иммунитета выполняет промежуточные функции специфического распознавания и запоминания болезнетворного агента и подключения средств врожденного иммунитета на заключительном этапе процесса. Таким образом, обе системы работают как единое целое, несмотря на то, что используют разные механизмы.
15.1. Система врожденного иммунитета
Система врожденного иммунитета, филогенетически более древняя, имеется у всех организмов. Факторы, обеспечивающие ее функционирование, постоянно присутствуют в организме, поэтому они первыми включаются в борьбу. Они достаточно разнообразны, но их можно сгруппировать следующим образом : кининовая система, барьерные свойства кожных и слизистых покровов, фагоцитоз, воспаление, комплемент, гуморальные защитные белки, натуральные киллеры.
Кининовая система входит в систему свертывания крови. Ее начальный компонент - фактор Хагемана, XII фактор свертывания крови, активируется в результате взаимодействия с чужеродными отрицательно заряженными веществами ( занозы, стекло и др.) и через каскад ферментативных реакций приводит к образованию брадикинина - пептида, состоящего из 9 аминокислотных остатков, - мощного активатора воспаления.
Барьерные свойства кожи и слизистых препятствуют проникновению чужеродных агентов в организм. Ранения, ожоги кожи и слизистой открывают ворота для инфекции.
Другая эффекторная система врожденного иммунитета - это фагоцитоз (рис. 52).
Рис. 52. Стадии фагоцитоза
Его осуществляют макрофаги и нейтрофилы. При этом макрофаги активируются и секретируют вещества, являющиеся медиаторами воспаления (ФНО, интерлейкины, интерферон, хемокины и т. д.). В то же время макрофаги осуществляют процессинг чужеродных веществ (антигенов) и представление его в форме, распознаваемой иммунокомпетентными клетками - Т-лимфоцитами.
Не менее мощной защитной системой является комплемент. Комплемент включает более 20 белков крови, которые, каскадно активируясь, превращаются в сеть протеолитических ферментов. Конечными членами этого каскада являются компоненты, способные при полимеризации образовывать мембраноатакующий комплекс, который формирует в мембранах бактерий или чужеродных клеток поры и вызывает их гибель. Кроме того, компоненты комплемента, присоединяясь к бактериям, делают их более фагоцитируемыми. Этот процесс называется опсонизацией. И, наконец, в результате активации комплемента происходит образование медиаторов воспаления, обеспечивающего защитную функцию (рис. 53).
Рис. 53. Основные функции комплемента
Помимо комплемента, в крови имеется гетерогенная группа белков, осуществляющих защитную роль (С-реактивный белок, интерлейкины, лизоцим, тромбоцитарный катионный белок, интерфероны и др.).
Среди факторов естественной резистентности есть клетки, способные убивать зараженные вирусом или мутировавшие клетки, а также клетки опухолей. Это так называемые натуральные киллеры.
Таким образом можно видеть, что все рассмотренные механизмы - суть одного - воспаления. Именно воспаление осуществляет главную функцию по очистке организма от патогенов. Основные признаки воспаления описаны еще в Египетских папирусах, относящихся к 1600 году д. н. э. В 1 веке н. э. римский врач Цельсис описал 4 главных признака воспаления - rubor, color, dolor, tumor (покраснение, жар, боль, припухлость). Гален добавил к этому - functio laesa (утрата функции).
Факторы врожденного иммунитета обеспечивают достаточную защиту беспозвоночных животных, у которых стратегия выживания основана на быстрой смене поколений и многочисленности потомства.
Несмотря на разнообразие факторов неспецифической резистентности организма, их слабость в том, что они одинаково реагируют на разные патогены, не различая их, т. е. являются относительно неповоротливыми. Будучи врожденными, они не могут угнаться за быстро изменяющимися паразитами, которые к тому же всяческими способами пытаются обойти систему защиты. Такие используют приспособления, что просто диву даешься! Есть такие микроорганизмы, которые используют макрофаги как свой дом, в котором живут припеваючи (микобактерии туберкулеза, возбудители проказы, лейшманиоза). Другие запросто спасаются от действия комплемента, образуя капсулу, не пробиваемую мембраноатакующим комплексом комплемента. Третьи секретируют ферменты, "срезающие" рецепторы фагоцитов, чувствительные к хемотаксическим молекулам, в результате чего макрофаги становятся неспособными двигаться в очаг воспаления. Четвертые выделяют смертельные яды, отравляющие организм хозяина. Вирусы из-за очень маленьких размеров вообще не захватываются фагоцитозом, а поражая клетки-мишени, они становятся совершенно неуязвимыми для факторов врожденного иммунитета. В общем, паразиты делают все, чтобы поживиться ресурсами многоклеточных организмов, обойти, обмануть и даже воспользоваться системой их защиты.
В этих ситуациях врожденный иммунитет бессилен. Организм спасает более изощренные и гибкие механизмы приобретенного иммунитета.
15.2. Система приобретенного иммунитета
Итак, животным, особенно длительно живущим, менее защищенным из-за отсутствия наружного скелета, обладающим более совершенной системой кровообращения, способствующей диссиминации инфекционных агентов, требовалась другая стратегия защиты. И она возникла на основе иммунной системы, и именно там, где она больше всего была нужна, т. е. у позвоночных, начиная с костистых рыб, и достигла совершенства у млекопитающих. У животных, обладающих иммунной системой, первая линия защиты при любой инфекции осуществляется действующими немедленно факторами врожденного иммунитета. Если они справляются с инфекцией полностью, развития иммунного ответа может и не быть. Если же агент пробивает эту первую линию обороны, после определенного латентного периода развивается иммунный ответ.
Для иммунной системы характерна высочайшая специфичность в распознавании чужеродных агентов - антигенов (АГ), а также способность запоминать первую встречу с ними и развивать при последующем контакте более энергичную иммунную реакцию на него. На генетическом уровне механизм распознавания бесконечного числа антигенов, порядка 108, обеспечивается механизмом, не имеющим аналогов в эволюции позвоночных - перегруппировкой отдельных зародышевых генных сегментов в онтогенезе для формирования зрелых генов, кодирующих вариабельные домены полипептидных цепей антигенраспознающих рецепторов В- и Т-лимфоцитов. Это обеспечивает генерацию их колоссального разнообразия, вполне соответствующего разнообразию антигенов и обеспечивающего надежность распознавания чужеродности. При этом в течение жизни организма ему вряд ли понадобится сотая часть от разнообразия этих белков. В то же время среди такого разнообразия клонов иммунокомпетентных клеток, рецепторы которых формируются случайным образом и вне зависимости от антигенов, могут быть аутоагрессивныеи, значит, иммунная система может быть опасной для того организма, в котором она развивается. Следовательно, в дополнение к этому беспрецедентному разнообразию иммунокомпетентных клеток должен формироваться механизм, обеспечивающий безопасность организменных структур.
АГ, попавший в организм, распознается рецепторами иммунокомпетентных клеток. Антиген играет роль селективного фактора - только те лимфоциты, рецепторы которых провзаимодействовали с АГ, вступают в пролиферацию и дифференцировку, образуя клоны, которые осуществляют эффекторную функцию иммунитета.
Эффекторные функции иммунитета разнообразны, но главными из них является антителогенез и цитотоксические клеточные реакции.
15.2.1. Антителогенез
Антитела (АТ), иммуноглобулины (ИГ) - удивительные белковые молекулы. С одной стороны, они обладают необыкновенным разнообразием, в силу чего могут с высокой степенью специфичности взаимодействовать с огромным числом АГ. С другой стороны, наблюдается и большое сходство между молекулами с разной АГ-специфичностью, и даже между АТ разных видов животных. Получаемые в ответ на иммунизацию определенным АГ антисыворотки содержат чрезвычайно гетерогенную популяцию АТ (АТ на разные детерминанты АГ, разные изотипы и аллотипы АТ). Это осложняло расшифровку первичной структуры АТ. Но, как говорится в пословице - не было бы счастья, да несчастье помогло. У человека и животных есть такой тип злокачественнных опухолей, которые представляют собой клон малигнизированных В-лимфоцитов (миелома) или плазматических клеток (плазмоцитома). Эти опухолевые клетки в большом количестве секретируют однородные АТ (миеломные белки). При этом легкие цепи иммуноглобулинов могут у пациентов выделяться с мочой.
Исследование этих белков позволило выявить структуру антител. При обработке папаином получалось три фрагмента с приблизительно одинаковой молекулярной массой (рис. 54). Два из этих фрагментов связывали АГ и отличались вариабельностью. Они были названы Fab1 и Fab2 (fragment antigen binding). Третий фрагмент АГ не связывал и характеризовался, напротив, высокой степенью гомологии у различных АТ одного и разных видов. Его назвали Fc - (fragment constant). Пепсин расщепляет молекулу АТ на 2 фрагмента - F(ab)2 и Fc. Первый в два раза больше второго, и, как и исходное антитело, бивалентно связывает АГ. Эдельман, обрабатывая АТ меркаптоэтанолом, рвущим дисульфидные связи, получил 4 полипептидных цепи - 2 легких (L - light) и 2 тяжелых (H - high). L-цепи имели молекулярную массу 25 кД, а Н-цепи - 50 кД. Ни одна из цепей не соединялась с АГ.
Рис. 54. Фрагменты, получаемые при гидролитическом расщеплении иммуноглобулинов
На основании этих исследований Портер и Эдельман создали модель АТ (рис. 54). Как было показано в дальнейшем, она полностью соответствовала действительности.
<< Пред. стр. 5 (из 6) След. >>
Список литературы по разделу