ПОПОВА Н А ВВEДEНИE В БИОЛОГИЮ НОВОСИБИРСК 2002 109 С 4

Рис. 32. L-образная структура тРНК.
В каждой клетке присутствует более, чем 20 видов индивидуальных тРНК, потому что несколько различных тРНК могут соединяться с одной и той же аминокислотой, такие тРНК называются изоакцепторными.
Транспортные РНК обладают двумя главными функциями - акцепторной, т. е. способностью ковалентно связываться с аминокислотным остатком и адапторной, т. е. способностью узнавать триплет и обеспечивать поступление аминокислоты на законное место в растущей полипептидной цепи. Присоединение аминокислоты к тРНК (аминоацилирование) катализируется ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами (АРС-азами). В клетке имеется 20 индивидуальных АРС-аз. АРС-азы с высокой степенью специфичности узнают свою тРНК (все изоакцепторные тРНК) и соответствующую ей аминокислоту. Очевидно, для этого у всех изоакцепторных тРНК должны быть некие общие свойства, распознаваемые одним и тем же ферментом. В настоящее время показано, что это определяется нуклеотидами, занимающими одни и те же места в структуре большинства тРНК. Они включают, прежде всего нуклеотиды антикодона, нуклеотид в положении 73, предшествующий ССА-концу, первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля. Экспериментальные данные показывают, что одни и те же участки тРНК узнаются АРС-азами из разных организмов. После специфического узнавания тРНК АРС-азой происходит подгонка двух макромолекул в результате изменения их конформации.

9. 3. 2. Рибосомный этап синтеза белка

Следующий этап проходит с участием рибосом и поэтому называется рибосомным. Он катализируется самой рибосомой без участия экзогенных ферментов. Итак, рибосома в процессе биосинтеза белка принимает кодированную генетическую информацию от ДНК в виде мРНК и расшифровывает ее, катализирует образование пептидных связей в реакции транспептидации, передвигает цепь мРНК и молекулы тРНК. Таким образом, рибосома - это сложная белоксинтезирующая частица, обладающая генетической (декодирующей), энзиматической (образование пептидных связей) и механической (передвижение мРНК) функциями.
Химически рибосома представляет собой рибонуклеопротеид. Она состоит из комплекса рибосомных РНК и белков. Физически рибосома представляет собой компактную частицу. Функционально - это молекулярная машина, протягивающая вдоль себя цепь мРНК, считывающая закодированную в мРНК генетическую информацию и параллельно, в соответствии с кодом, синтезирующая полипетидную цепь белка из поступающих в нее аминокислотных остатков. Электронно-микроскопическое изображение рибосомы показывает, что она состоит из двух неравных частиц - большой и малой, довольно лабильно ассоциированных друг с другом. Рибосомные РНК концентрируются ближе к центру частиц, а рибосомные белки занимают периферию. Каждая рибосомная частица содержит много белков и все они разные. Основная морфологическая черта электронно-микроскопических изображений рибосомы - это борозда, разделяющая две рибосомные частицы. В одном месте она расширяется, образуя так называемый "глаз". В этой полости размещаются основной субстрат рибосомы - тРНК.
Теперь рассмотрим отдельно малую субъединицу рибосомы. Она разделяется глубокой бороздой на головку и тело. В ней размещается участок связывания мРНК и через нее цепь мРНК протягивается от одного конца к другому в процессе трансляции. В большой субъединице рибосомы тоже есть борозда, разделяющая головку и тело. В ней располагается главный каталитический центр рибосомы, осуществляющий синтез полипептидных цепей.
Трансляция состоит из трех стадий : инициации, элонгации и терминации (рис. 33). Самым ответственным этапом является инициация. Для осуществления ее в клетке имеются специальные механизмы.
Трансляция начинается с того, что мРНК связывается с рибосомной частицей. При этом рибосомная частица (у прокариот прямо и непосредственно, а у эукариот после некоторого скольжения вдоль некодирующей части мРНК) специфически взаимодействует с началом кодирующей нуклеотидной последовательности мРНК, с кодоном AUG. Вслед за инициацией рибосома последовательно триплет за триплетом считывает цепочку мРНК, по направлению к 3'-концу, наращивая цепочку полипептида. Этот этап называется элонгацией. Достигнув стоп-кодона, рибосома освобождает синтезированную цепь - это терминация трансляции.

Рис. 33. Трансляция у про- и эукариот.

Необходима абсолютно точная инициация, так как правильная трансляция зависит от правильной рамки считывания. Если произойдет сдвиг рамки считывания, то образовавшиеся стоп-кодоны прекратят синтез еще до образования полноразмерного пептида. Дефектный пептид быстро деградирует.
Характерной особенностью инициации трансляции является то, что на этом этапе участвуют не целые рибосомы, а только их отдельные субъениницы (рис. 34). Поэтому, чтобы началась трансляция, рибосома должна диссоциировать на две ее составляющие части. Именно малая единица рибосомы, и только она, связывается с мРНК и удерживает ее. При этом в связывании с мРНК вовлечен участок в 30 нуклеотидов, но в каждый момент только две тРНК могут разместиться в рибосоме. Большая единица рибосомы с мРНК никак не взаимодействует.
Все начинается со связывания инициаторной метиониновой тРНК в Р-участке рибосомы с кодоном AUG (рис. 34). Этот же кодон кодирует метионины, находящиеся повсюду в молекуле белка. Оказывается, существуют две разные тРНК для метионина. Одна для инициации, а другая - для добавления метионина в процессе элонгации. Инициаторная тРНК имеет структурные особенности, которые распознаются белковым фактором инициации IF2. Последний и доставляет ее к инициаторному комплексу. Элонгаторная метиониновая тРНК распознается другим белковым фактором, который также доставляет ее к рибосоме.
На рибосоме имеются два участка связывания с тРНК. А-участок, акцепторный, т. е. участок, который может быть занят очередной вновь поступающей аминоацил-тРНК. До того, как в А-участок придет аминоацил-тРНК, в этот участок входит триплет (кодон), кодирующий аминокислоту, которая должна быть включена в пептид.Другой участок Р-участок - пептидил-тРНК-связывающий, или донорный (рис. 35).
Механизм элонгации заключается в следующем. Инициаторная тРНК поступает в Р-участок. Затем в А-участок малой субъединицы рибосомы поступает тРНК, нагруженная той аминокислотой, которая кодируется следующим за инициаторным кодоном. Получается, что два аминокислотных остатка, каждый из которых присоединен к соответствующей тРНК, находятся вблизи рибосомной пептидилтрансферазы. В таком состоянии происходит реакция транспептидации, т. е. переход метионина из Р-участка рибосомы на свободную аминогруппу аминокислоты в А-участке. В Р-участке тРНК остается ненагруженной аминокислотой, поэтому она высвобождается. Далее тРНК движется из участка А в Р, таща за собой связанный

Рис. 34. Инициация трансляции.

с ней триплет мРНК. Так цепь мРНК протаскивается относительно рибосомы ровно на один триплет. В этом процессе участвует фактор EF-G (транслоказа) и теперь в А-участке устанавливается смежный с предыдущим триплет нуклеотидов, то есть следующий кодон.

Рис. 35. Элонгация трансляции.

Все готово для следующего раунда элонгации. Далее аналогичным способом аминоацил-тРНК, соответствующая вновь установленному в А-участке кодону, связывается с ним.Полипептидная цепь удлиняется на одну аминокислоту, на ту, которая принесена тРНК в А-участок. Сама тРНК, принесшая эту аминокислоту, так и остается с ней связанной, а следовательно связанной и с удлиненным полипептидом. За образование пептидных связей отвечает большая единица рибосомы. В элонгации участвует много белковых факторов - EF-Tu, EF-G и другие. Все они обладают ГТФ-азной активностью.
Итак, мы видим, что на всех этапах синтеза белка работают механизмы, отвечающие за точность этого процесса. Хотя следует заметить, что ошибка в биосинтезе белка не имеет серьезных последствий, так как образуется множество молекул белков. Другими словами, эти ошибки не имеют таких далеко идущих последствий, как ошибки при репликации ДНК.

Глава 10. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И РОЛЬ ЕЕ НАРУШЕНИЙ В ПАТОЛОГИИ

Образование полипептидной цепи - это только первый шаг в процессе формирования белка. Для образования функционально активного белка полипептидные цепи претерпевают ряд изменений. Для функционирования ряда белков необходимо объединение нескольких полипептидных цепей. Так, гемоглобин образуется при объединении двух ?- и двух ?-цепей, а также после связывания с ними гемогруппы. Некоторые белки подвергаются гидроксилированию, фосфорилированию или дефосфорилированию. Многие белки синтезируются в виде крупных предшественников, а потом активируются путем отщепления частей полипептидных цепей. Например, сначала образуется проинсулин, затем он расщепляется с удаление N-концевого и внутреннего фрагмента цепи.
Во-первых, за счет взаимодействия аминокислотных остатков полипептиды автоматически сворачиваются, образуя вторичную и третичную структуры (См. рис. 28). Существовало представление, что поскольку структуру белка определяет лишь последовательность нуклеотидов в гене, сворачивание полипептидной цепи зависит и определяется только последовательностью аминокислот. Для этого утверждения были экспериментальные подтверждения. Так, Анфинцен показал, что если РНК-азу денатурировать, а потом удалить из раствора денатурирующие агенты, фермент вновь восстанавливал свою нативную структуру и проявлял каталитическую активность. В дальнейшем было выяснено, что не для всех белков это так. Оказалось, что для большинства белков процесс их сворачивания является энергозависимым и ни в коем случае не спонтанным. Он имеет иерархическую природу. Сначала за доли секунды формируются элементы вторичной структуры. Затем также за доли секунды происходит специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры - это сочетания нескольких ?-спиралей, нескольких ?-пластов или смешанные ассоциаты этих элементов. Далее образуется третичная структура, в основном за счет гидрофобных взаимодействий. А ведь многие белки составлены из нескольких полипептидных цепей, значит должны установиться дополнительные контакты между доменами этих цепей. Действительно, в цепи аминокислот имеются практически безграничные возможности ассоциации аминокислотных остатков друг с другом. Если полипептид будет "пробовать" все мыслимые варианты такой ассоциации, пока не достигнет формы нативного белка, ему понадобится несколько миллионов лет. В клетке же это происходит в считанные минуты.
В середине 80-х годов было обнаружено, что в клетке существует особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. Эти белки названы молекулярными шаперонами. Они не дают полипептиду образовывать нежелательные связи. Это и отражено в их названии ( французское слово chaperone означает гувернантка). Это целое семейство белков со сходной функцией. Есть еще белки - шаперонины - более сложно устроенные, представляющие собой сложные ологимерные структуры. Несколько олигомеров образуют цилиндр с полостью в центре - каналом, в котором и происходит процесс сворачивания белка. Для проникновения белков через мембрану митохондрий и хлоропластов необходимо их развернуть, это тоже делают шапероны. Известно, что синтез шаперонов индуцируется под влиянием теплового шока, стресса, радиации, ултрафиолетового излучения. Поэтому шапероны называют белками теплового шока или белками стресса. По этому их проявлению впервые и были открыты белки теплового шока. Открытие сделано работами Риттозы на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы. При повышении температуры до 370 С (а оптимум для дрозофилы 20?С) образовывались пуфы там, где их не было раньше. Идентифицированы эти белки в 1974 году. После денатурации в результате этих воздействий конформацию белков восстанавливают шапероны. Шапероны метят белки, которые должны быть деградированы в лизосомах. Известен среди них убиквитин, осуществляющий эту функцию, его называют меткой смерти. Шапероны участвуют также в сборке крупных белковых комплексов, работающих как молекулярные машины.
Помимо шаперонов и шаперонинов, в сворачивании (фолдинге) белка принимают участие и другие белки-ферменты. К ферментам, участвующим в фолдинге, относится протеиндисульфид-изомераза, перемещающая дисульфидные связи в полипептидной цепи, разрывая недопустимые и создавая новые S-S связи между остатками цистеина. Другой фермент из этой группы - пептидил-пролин-изомераза катализирует изомеризацию пептидных связей пролина.
Белки синтезируются в цитоплазме клеток, а также в митохондриях и хлоропластах. Они при этом имеют разные пункты назначения. Какие-то из них остаются в цитоплазме, другие встраиваются в клеточную мембрану, третьи проникают в лизосомы и пероксисомы, четвертые идут в ядро, митохондрии, хлоропласты и т.д.

Рис. 36. Перенос полипептида в цистерны ЭПР

В эукариотических клетках для обеспечения транспорта белков имеется сложный аппарат. Белки, предназначенные для некоторых органелл и цитозоля (водной фракции цитоплазмы) синтезируются на свободных рибосомах, а белки, остающиеся в лизосомах, аппарате Гольджи и в мембранах, синтезируются на рибосомах, ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР). ЭПР - это сложная сеть мембран, ограничивающая огромное количество сплющенных полостей. ЭПР с прикрепленными к нему рибосомами называется шероховатым, не связанный с рибосомами - гладким. Белки, предназначенные для экспорта к одной из клеточных мембран или внутриклеточным органеллам, имеют так называемую сигнальную последовательность, которая прокладывает белку путь в просвет ЭПР (рис. 36).
Сначала сигнальный полипептид связывается с рибонуклеопротеидной сигнальной распознающей частицей (СРЧ). СРЧ в свою очередь связывается с рецептором на мембране ЭПР. Таким образом рибосома прикрепляется к ЭПР. Синтезирующийся полипептид постепенно втягивается в просвет ЭПР через белковую пору. В просвете ЭПР сигнальный пептид отщепляется эндопептидазами. В просвете ЭПР происходит существенная модификация белков, а именно гликозилирование, т. е. присоединение углеводных остатков к NH2 - группе аспарагина. Далее белки окружаются мембраной, образуя везикулу и отпочковываются от ЭПР. Везикулы доставляют белок в аппарат Гольджи путем слияния его с мембраной (рис. 37).
Аппарат Гольджи является удивительной органеллой эукариотической клетки. Структура его проста - это ряд замкнутых мешочков, ограниченных мембранами, но у него очень важная функция. Аппарат Гольджи сортирует белки, упаковывает их в везикулы и доставляет, куда нужно, по точно указанным адресам. Предназначенные для экскреции белки в составе пузырьков мигрируют к плазматической мембране. Далее посредством экзоцитоза, они освобождаются из клетки. Например, таким образом происходит секреция ферментов из клеток поджелудочной железы (рис. 37).
Для белков, направляемых в лизосомы, адресом является их углеводная часть. Лизосомы - это небольшие окруженные мембраной внутриклеточные органеллы, содержащие высокоактивные гидролитические ферменты. Эти ферменты узнаются в аппарате Гольджи, происходит их фосфорилирование, после чего они отпочковываются от аппарата Гольджи в виде лизосом. При нарушении фосфорилирования не происходит поступление ферментов в лизосомы и развивается тяжелейшее наследственное заболевание - синдром Гоше.

Рис. 37. Путь полипептидов через аппарат Гольджи.

В ЭПР образуются также мембранные липиды и новые мембраны. Интегральные белки мембран идут тем же путем, но за счет гидрофобных аминокислот заякориваются в мембране.
Время существования белков в клетке сильно варьирует. Некоторые белки имеют период полужизни более 20 часов (белки печени - несколько дней), а другие 10 или даже 2 минуты. Структурные белки и гемоглобин являются долгожителями.
Быстро деградируют белки, содержащие неправильные аминокислоты, что обусловливает их неправильный фолдинг. Белки, пострадавшие от химических воздействий, например, окисления, также должны быть уничтожены. В деградации долгоживущих белков участвуют лизосомы.

10. 1. Прионы - инфекционные агенты нового типа?

Изменение фолдинга белка, который называют прионом, лежит в основе развития вялотекущих заразных губчатых энцефалопатий. Эти заболевания объединяют термином прионовые. Ген прионового белка очень консервативен и имеется у всех млекопитающих. У человека он кодируется в коротком плече 20-й хромосомы. Формы нормального и прионового белка кодируются одним и тем же геном и имеют одинаковую последовательность аминокислот. А вот их трехмерная форма существенно различается. Несмотря на то, что исследования агента, вызывающего эти заболевания, отмечены уже двумя Нобелевскими премиями, окончательной ясности в этой проблеме до сих пор нет. Бесспорно одно: заболевание поражает и людей, и животных, и люди могут заразиться от животных, а также через хирургические инструменты, биопрепараты и т. п. Так что это еще одна экологическая угроза человечеству.
Одна из этих болезней - скрепи овец, известна еще с XVIII века. У больных животных вначале наблюдается расстройство координации движений, затем наступают параличи и смерть.
В 1947 г. на одной из звероводческих ферм США была обнаружена энцефалопатия норок, которая возникла после скармливания им субпродуктов от овец, больных скрепи. Когда эта причинная связь была установлена и приняты соответствующие меры, заболевание прекратилось.
У человека сходную картину заболевания наблюдал и изучал сначала Якоб в 1921 г. (болезнь Кройцфельда - Якоба), а затем Даниель Карлтон Гайдушек в середине 50-х гг. в племени форе Новой Гвинеи (болезнь куру). Оба заболевания характеризовались различными неврологическими симптомами и слабоумием. Гайдушек установил, что распространение куру связано с ритуальным каннибализмом в этом племени. Гайдушек заразил обезьян экстрактами мозга людей, умерших от куру. У последних через 2 года появились первые симптомы заболевания. В 1971 г. подобным образом осуществили передачу болезни Кройцфельда - Якоба от человека животным. К прионовым заболеваниям человека относсится также синдром Герстманна-Шейнкера и фатальная семейная бессонница. В 1976 г. Гайдушек был удостоен Нобелевской премии за расшифровку механизмов губчатых энцефалопатий, хотя на самом деле до открытия механизмов было еще далеко. Предполагалось, что этиологическим фактором болезни являются медленные вирусы, которые, однако, не были выделены. Не выделены они и до сих пор.
В 1974 г. Стенли Прузинеру с сотрудниками удалось получить достаточное количество очищенного агента скрепи. Исследование его свойств показало, что агент исключительно белковой природы, устойчив к ультрафиолетовому и ионизирующему излучению, нагреванию, обработке ферментами. Прузинер выдвинул гипотезу "только белок" (protein only), говорящую о том, что инфекционным агентом скрепи и других губчатых энцефалопатий является белок, с молекулярной массой 27-30 кД, имеющий 3-х-мерную форму, отличную от аналогичного нормального белка. Прузинер назвал этот белок прионом, а соответствующие заболевания - прионовыми. Показано, что в нормальном прионовом белке больше Рис. 38. Конформация нормального ?-спиралей, а в патологическом больше ?- пластов (рис.
и прионового белка 38).
По гипотезе Прузинера аномальная конформация белка приона может передаваться молекулам нормального белка. Возникает вопрос, каким образом неправильно свернутый белок может стать инфекционным и воспроизводить самого себя? Ни один из рассмотренных нами механизмов образования белка не позволяет белковой молекуле управлять своей собственной репликацией. Как бы то ни было, поведение этого белка противоречит догме классической генетики. И хотя за исследование прионов Прузинер в 1997 г. награжден Нобелевской премией, многое в этой проблеме остается неясным. Возможно, что процесс "прионизации" обусловлен тем, что шапероны по каким-то причинам не помогают складываться этому белку в правильную третичную структуру.
У дрожжей обнаружены белки - аналоги прионов человека. Они также состоят преимущественно из ?-пластов и тоже склонны к олигомеризации. Олигомеризованные формы белка проявляют повышенную протеазоустойчивость. Еще один прион обнаружен у гриба Podospora anserina. Постепенно накапливающиеся в этой области данные грозят крушением некоторых привычных представлений о реализации генетической информации. По крайней мере, уже сейчас ясно, что одной первичной структуре белка может соответствовать не одна нативная конформационная структура белка и не один уровень ферментативной активности. Возможно, это до сих пор неизвестный уровень эпигенетического контроля трансляции белков и, что самое интригующее, наследование модификаций на уровне конформации белка. Значит, наследственные изменения не сводятся только к мутациям.
Нормальный белок приона экспрессируется в клетках мозга, особенно в синапсах. В легких, селезенке и мышцах содержание этого белка в 10-15 раз меньше, чем в нервной ткани. До сих пор роль этого белка неизвестна. Интересно, что нокаутированные по гену приона мыши, не экспрессирующие этот белок вообще, нормально существуют. Когда прион становится патогенным, он накапливается в мозге в больших количествах в виде волокон или палочек, образующих амилоидные бляшки. Ген прионового белка находится у человека в 20-й хромосоме. В настоящее время он клонирован и изучена его структура. Ген оказался консервативным у млекопитающих. Описаны мутации в гене приона, которые обусловливают наследственные формы болезни Кройцфельда - Якоба и семейную фатальную бессонницу. Одни мутации представлены точковыми аминокислотными заменами в полипептидной цепи белка, другие - увеличением числа повторов в N-концевой части белка. Есть данные, что эти повторы существенны для превращения белка в патологическую конформацию.
Изучение патогенеза прионовых заболеваний показало, что для переноса инфекции от одного животного к другому необходима нормальная экспрессия нормального гена приона. Нокаутированных мышей, у которых ген приона отсутствует, заразить инфекционным прионом не удается. Выяснено также, что повышенная экспрессия нормального гена приона также приводит к развитию заболевания губчатой энцефалопатией. Это как будто подтверждает предположение, что возможна спонтанная перестройка нормального прионового белка в патологический.
С экологической точки зрения интерес представляет возможность межвидового переноса прионовых агентов. Особенно актуальна эта проблема в связи с опасностью заражения человека от больных животных. Попытки заражения мышей хомячковым и коровьим прионом сначала дали отрицательные результаты, однако впоследствии мыши все же заболели. Просто в этих случаях латентный период был гораздо больше, чем при заражении мышей мышиным прионом.
А теперь вспомним эпидемию коровьего бешенства в Англии, которая началась в середине 80-х годов после того, как были изменены условия приготовления пищевых добавок к корму крупного рогатого скота из органов овец, больных скрепи. В 1996-1997 гг. эпидемия достигла небывалых размеров, пришлось уничтожить 130 тыс. больных коров. Ущерб составил 300 млн. фунтов стерлингов. Есть предположение, что 900 тысяч коров, находящихся в инкубационном периоде энцефалопатии, были съедены в основном в Англии. Английские ученые предсказывают в связи с этим проявление прионовой патологии у 70-80 тысяч англичан. То, что болезнь Кройцфельда - Якоба можно передать от человека обезьяне, доказал в своих исследованиях еще Гайдушек. До него это заболевание заразным не считалось. В процессе развития эпидемии коровьего бешенства в Англии появилась новая нетипичная форма болезни Кройцфельда - Якоба. Появление ее связывают с заражением людей через мясо больных коров. Белок прион этих больных очень похож на коровий и отличается от типичных прионов, характерных для ранее встречавшейся болезни Кройцфельда - Якоба. Прионовый агент настолько устойчивый, что никакая термическая обработка мяса его не инактивирует.
Человек может заразиться и от больного человека( при лечении препаратами гормонов из гипофизов трупов, а также при пересадке твердой оболочки мозга, либо при введении биопрепаратов). Какова роль в развитии описываемых заболеваний иммунной системы? Распознает ли она прионовый агент? Развиваются ли при попадании приона в организм эффекторные реакции иммунитета и какие? Все эти вопросы волнуют исследователей с самого начала открытия прионов. Показано, что специфическая иммунологическая реакция, направленная на элиминацию прионовых агентов, не развивается. Само по себе это представляется странным: изменилась первичная структура белка и его конформация, что однако совершенно не замечается иммунной системой. Тем не менее, иммунная система не остается безучастной к ним. При любом способе заражения инфекционный агент не сразу попадает в мозг. Показано, что он длительно может персистировать в лимфоузлах, миндалинах, пейеровых бляшках и селезенке. Спленэктомия, произведенная до или в короткое время после заражения мышей прионами, значительно удлиняла латентный период заболевания. Тимэктомия подобного эффекта не вызывала. Если же инфекция уже локализовалась в нервной системе, спленэктомия ничего не изменяла. У мышей с тяжелым комбинированным дефицитом, у которых наряду со зрелыми Т- и В-лимфоцитами, отсутствуют и дендритные клетки, вызвать инфекцию прионами не удается.
Все это доказывает важность периферического периода в течение прионового заболевания. Кроме того, что очень важно, эти данные фокусируют внимание исследователей на существовании реальной опасности горизонтального переноса прионовых заболеваний путем гемотрансфузии, трансплантации органов и тканей, а также через хирургические инструменты.
Интересно, что разного рода воздействия, стимулирующие иммунную систему, повышают чувствительность мышей к заражению агентом скрэпи, а иммунодепрессанты, наоборот, уменьшают эту чувствительность.
В патогенезе прионовых заболеваний остается много неясного. Не все ученые разделяют точку зрения, что прионовый белок является непосредственным этиологическим фактором указанных заболеваний. Они предполагают, что причина не выяснена и что прион - это лишь свидетель неизвестного инфекционного агента.

Глава 11. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ

Функции и морфология разных клеток одного организма порой так сильно отличаются, что трудно представить, что они обладают одним и тем же геномом. Тем не менее это так. Дифференцировка клеток, в результате которой они становятся мало похожими друг на друга внешне и выполняют разные функции, определяется изменением экспрессии генов, не сопровождающимися, как правило, изменениями в последовательности ДНК. В результате в клетках разных типов или на разных стадиях развития клеток одного типа синтезируются разные наборы белков. Некоторые исключения из этого правила касаются работы генов, кодирующих иммуноглобулины, мембранные формы которых являются антигенраспознающими рецепторами В-лимфоцитов, и Т-клеточные антигенраспознающие рецепторы.
Механизмы регуляции генов стабильны и передаются по наследству от клетки к клетке. Это подтверждается экспериментами in vitro - при выращивании вне организма на культуральной среде определенного типа клетки сохраняют свои уникальные свойства.
Регуляция генной активности сложна и многогранна из-за необычайного разнообразия участвующих в ней процессов и проходит на всех уровнях реализации генетической информации от ДНК к РНК и белку, т.е. на уровне репликации, транскрипции, трансляции и посттрансляционной модификации белков.
Для большинства генов наиболее важным является контроль на уровне транскрипции. Он осуществляется специальными белками, специфически связывающимися с ДНК в области промотора гена. Результатом этого связывания может быть как активация работы гена, так и подавление ее. Разные типы клеток обладают разным набором таких регуляторов и, следовательно, разными наборами активированных генов. Гены высших эукариот обычно регулируются путем комбинированного воздействия нескольких белков - факторов транскрипции. В отличие от прокариот, у которых фермент РНК-полимераза узнает сайт инициации транскрипции непосредственно, у эукариот транскрипция представляет собой гораздо более сложный процесс. В ней принимают участие три РНК-полимеразы - I,II,III, эволюционно родственные ферменту бактерий, но содержащие большее число субъединиц. Эукариотическая РНК-полимераза узнает комплекс ДНК со специфическим фактором транскрипции. Фактор связывается с последовательностью ТАТА, расположенной на участке 25-30 п.н. от сайта инициации транскрипции. Оказалось, что для эффективной транскрипции необходимо взаимодействие факторов транскрипции с сайтами ДНК, находящимися на большом отдалении от промотора, на десятки тысяч п.н. Одни из них - энхансеры, т. е. усилители. Соединение с ними факторов транскрипции усиливает транскрипцию. Противоположным эффектом обладают сайленсеры, т. е. сайты ДНК, которые, взаимодействуя с факторами транскрипции, ингибируют ее. Эффект энхансеров и сайленсеров, находящихся в большом отдалении от промотора, возможен благодаря гибкости ДНК, что позволяет присоединившимся к ним белкам влиять на РНК-полимеразу. Включение и выключение гена обусловлено взаимодействием с сайтами ДНК, с РНК-полимеразой и друг с другом многих факторов транскрипции. Для каждого типа клеток набор факторов транскрипции является уникальным.
Рассмотрим способ регуляции активности генов путем возникновения перестроек генетического аппарата, возникающих в онтогенезе. Такие перестройки распространены у одноклеточных организмов и в соматических клетках многоклеточных. Многие из них происходят случайно, другие запрограммированы и приурочены к определенным стадиям дифференцировки клеток и связаны с этими стадиями.
Перестройки генетического материала обусловлены гомологической и негомологической рекомбинациями, т.е. перераспределением генетического материала (ДНК), приводящими к возникновению новых комбинаций генов. В отличие от репликации и репарации, обеспечивающих воспроизведение и сохранение генетического материала, рекомбинация приводит к генетической изменчивости.
Гомологическая рекомбинация приводит к обмену гомологичными участками хромосом. Биологическое значение гомологической рекомбинации велико. Она вносит вклад в генетическую изменчивость, позволяющую организмам приспосабливаться к среде обитания. Негомологическая рекомбинация - это процесс, использующий очень ограниченную гомологию между рекомбинирующими участками, либо вообще обходящийся без нее. К последней относятся сайт-специфическая рекомбинация, транспозиции и незаконная рекомбинация.
К сайт-специфической рекомбинации относятся перестройки в последовательностях ДНК, кодирующих иммуноглобулины и рецепторы Т-лимфоцитов. Транспозиции - это перемещение подвижных генетических элементов - транспозонов. Незаконная рекомбинация происходит без гомологии между участками ДНК, а также без сайт-специфической рекомбинации и транспозиции. Примерами незаконной рекомбинации являются захват ретровирусами участка ДНК и перенос в другое место, в другой организм, а также интеграция ДНК, вводимой в клетку инъекцией. Примерами сайт-специфической перестройки является инверсия сегмента Н в хромосоме S.typhimurium, ответственного за смену жгутиковых антигенов. Это обеспечивает выживание бактерий в условиях иммунного ответа хозяина. За счет смены антигена они избегают развившихся эффекторных реакции иммунитета и обеспечивают новую волну инфекции. Хозяин включается в борьбу с новыми антигенами. Так продолжается гонка между паразитом и хозяином. До окончательной победы....
Еще один механизм регуляции активности генов путем перестроек - это диминуция хроматина. Она описана у нематод еще в 1887 году классиком клеточной биологии Т. Бовери. Диминуция заключается в фрагментации и элиминации значительной части генома. При диминуции может удаляться до 85% хроматина. Это оригинальный метод выключения генов - его удаление. В противоположность этому, запрограммированная амплификация (увеличение числа его копий) генов - механизм усиления функционирования генов. Амплификация генов описана в генах рибосомных РНК и гистонов в ооцитах многих организмов.
Самый яркий пример запрограммированной перестройки генов - это формирование генов путем перестройки генных сегментов для образования зрелых генов, кодирующих иммуноглобулины (рецепторы В-лимфоцитов) и рецепторы Т-лимфоцитов. Эти процессы являются тканеспецифическими, т. е. происходят только при дифференцировке В- и Т-лимфоцитов. Каждый этап перестройки, а их несколько, приурочен к строго определенной стадии дифференцировки. Этот механизм обеспечивает беспрецедентное разнообразие генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов при использовании относительно небольшого числа зародышевых генных сегментов. Подробнее этот механизм описан в главе.....
Суммируем основные механизмы регуляции работы генов, ради которых происходят перестройки:
подстановка кодирующей рамки гена под промотор
состыковка разобщенных частей гена
удаление гена из генома
амплификация гена
Необходимо отметить, что из этих механизмов вытекает одно важное обстоятельство - а именно, что в разных клетках организма, возникших из одной оплодотворенной яйцеклетки, могут быть различия в структуре генетического материала.
В 70-х годах 20 века в области молекулярной биологии было сделано удивительное открытие. Оказалось, что в ДНК есть фрагменты, которые могут перемещаться как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они были названы мобильными элементами, или транспозонами. Размеры транспозонов сопоставимы с размерами генов, локализация которых в геноме стабильна, т.е. они включают от тысячи до десятков тысяч пар нуклеотидов.
Перемещения транспозонов - транспозиции осуществляются с помощью белков-ферментов. Они производят либо вырезание транспозона из одного места и встраивание его в другое, либо образуют сначала копию транспозона и ее внедряют в новое место, при этом родительская копия остается на прежнем месте. В последнем случае наблюдается размножение транспозонов в геноме.
Открытие транспозонов опровергло существовавшую в молекулярной биологии догму относительно неизменности последовательности нуклеотидов ДНК по длине хромосомы. Оказалось, что последовательность их может изменяться, благодаря перемещению фрагментов ДНК.
Встраиваясь в окрестности гена, транспозоны могут вызывать мутации, называемые инсерционными (insertio - вставка). Так, например, у плодовой мухи дрозофилы подавляющая часть спонтанных мутаций (до 80%) обусловлена внедрением транспозонов.
Подвижные элементы часто называют по их способности перемещаться - Магеллан, Бигль, hobo - бродяга, gypsy - цыган и др. Авророй остроумно назван транспозон, подвижный в прошлом и заякоренный в настоящее время.
Транспозоны вездесущи. Они обнаружены у прокариот и эукариот, у растений и животных. Транспозоны эукариот представлены несколькими семействами. Обычно они рассеяны по геному, составляя 10-40% генома, но иногда могут концентрироваться в некоторых участках. У бактерий транспозоны могут содержать гены устойчивости к антибиотикам.

Рис. 39. Структура транспозонов, механизм перемещения и их участие в репарации.

Перемещения транспозонов - достаточно редкие явления. Например, у бактерий - один акт перемещения на 10000 - 1000000 клеток. Однако при определенных внешних воздействиях ( стрессе, вызванном изменением температуры, облучением) частота перемещений может сильно возрастать, так что составит частоту - 1 акт на 10- 100 особей за поколение.
В зависимости от молекулярных механизмов, обеспечивающих перемещение, транспозоны разделяются на собственно транспозоны и ретротранспозоны.
Транспозоны (рис. 39) обязательно включают ген, кодирующий транспозазу и ограничивающие его инвертированные повторы. Инвертированные повторы сближаются и точно вырезаются из ДНК вместе с геном транспозазы. Транспозаза делает разрыв в ДНК-мишени и вносит вырезанный фрагмент ДНК. Брешь в ДНК после вырезания транспозона застраивается транспозазой с участием гомологичного участка сестринской хромосомы, только что реплицированной.
Другой класс подвижных элементов - ретротранспозоны. Механизм их перемещения связан с работой обратной транскриптазы, фермента, открытого Г. Теминым и Д. Балтимором в 1970 году. Обратная транскриптаза была обнаружена при изучении ретровирусов, содержащих РНК, которая служит матрицей для синтеза ДНК. При этом обратная транскриптаза осуществляет и синтез второй цепи ДНК, а РНК-матрица удаляется и распадается. Вновь синтезированная ДНК перемещается в ядро и может встроиться в хозяйскую хромосому, образуя провирус. Провирус стабильно наследуется в ряду поколений клетки, как обычный ген. В геноме млекопитающих в большом количестве содержатся эндогенные провирусы, которые безвредны. Провирус ограничен длинными концевыми повторами (long terminal repeаts - LTR). Они необходимы для его репликации и транскрипции. Один из них является промотором, с которым взаимодействует РНК-полимераза. Синтезированная РНК в дальнейшем транслируется с образованием белков, необходимых для формирования вирусных частиц, а также белков, необходимых для синтеза ДНК провируса и его внедрения в геном. Образовавшиеся вирусные частицы могут из клетки выйти и заразить другие клетки. Транспозаза, в отличие от ДНК-полимеразы, работает с ошибками. Может случиться, что в состав будущего провируса попадет материал других клеточных генов, например, управляющих пролиферацией. Это может обусловить злокачественное перерождение клеток.
Структуру провирусов фактически повторяют ретротранспозоны. Отличие лишь в том, что ретротранспозоны не имеют генов, кодирующих белки вирусной оболочки и, следовательно, они не инфекционны, так как не могут выйти из клетки и заразить другие клетки.
Остается открытым вопрос, произошли ли ретровирусы от ретротранспозонов, или, наоборот, ретротранспозоны возникли из вирусов, утратив способность к заражению.
Отношение к подвижным элементам ДНК как к эгоистической ДНК, которая паразитирует в ДНК хозяина и занимается только своим размножением, в последние годы изменилось. В главе 4 расмотрена проблема недорепликации ДНК и достраивания концов хромосом с помощью теломеразы. Оказалось, что иногда укороченные концы хромосом восстанавливаются за счет транспозонов. Например, у дрозофилы отсутствует теломеразный механизм, а утраченные концы хромосом восстанавливаются за счет ретротранспозонов. В этом случае они выступают как спасатели хромосом.
Подвижные элементы иногда используются клеткой для залечивания двунитевых разрывов ДНК. Заплатка в виде транспозона позволяет хромосоме не утратить оторванный от центромеры фрагмент. Конечно, при этом исходная последовательность нуклеотидов не будет восстановлена. Однако если этот район ДНК не содержит генов, то клетка полностью сохранит жизнеспособность.
Помимо этих важнейших функций, транспозоны могут участвовать в регуляции экспрессии генов. Внедряясь в ген, транспозон может разорвать экзон; в этом случае ген лишиться возможности кодировать белок. Внедряясь в район промотора, сайты энхансеров или сайленсеров, он может нарушить регуляторную область гена. Только попадание в интрон может быть безвредным, если вся последовательность интрона вместе с транспозоном будет вырезаться при процессинге РНК.
При рассмотрении роли транспозонов в регуляции экспрессии генов не стоит забывать, что они имеют собственные промоторы и сайты терминации транскрипции, а также экзоны, интроны и сигналы, обеспечивающие сплайсинг.
Внесение с транспозоном нормального регулирующего сигнала может привести к усилению транскрипции гена. Если этим геном окажется протоонкоген, может начаться сверхпродукция соответствующего белка, ведущая к злокачественной трансформации клетки.
Есть данные, что в эволюции генома регулирующие сайты подвижных элементов превращаются в энхансеры клеточных генов. Так, белок-рецептор ретиноевой кислоты узнает регуляторную последовательность гена, которая была приобретена в результате внедрения подвижного элемента. Ретротранспозон может привести к экспрессии гена в ткани, где он обычно молчит.
Подвижные элементы могут принимать участие в хромосомных перестройках. Процесс рекомбинации в присутствии подвижных элементов может изменить свой характер. Так, в результате неравного кроссинговера, проходящего по встройке подвижного элемента, может образоваться делеция или дупликация генов.
Еще один способ регуляции активности генов заключается в метилировании ДНК. Более 50 лет тому назад в ДНК было обнаружено азотистое основание - 5-метилцитозин. Сначала предположили, что оно, подобно четырем основным основаниям, в составе нуклеотидов включается в ДНК при ее репликации. Однако вскоре выяснилось, что цитозин метилируется уже после начала репликации специальным ферментом - ДНК-метилтрансферазой. В ДНК позвоночных метилируется цитозин в положении ЦГ, т. е. когда за ним следует гуанин. Метилирование ДНК, открытое еще до открытия двойной спирали ДНК, остается до сих пор наиболее старой из нерешенных проблем. Трудно назвать генетические процессы, в которых не участвует метилирование ДНК - оно влияет на экспрессию генов, репликацию и репарацию ДНК, активацию хромосом , разрывы, обмены, образование Z-формы и другие процессы. Подобная полифункциональность не знает аналогии в клетке. В то же время, если метилирование так важно, то почему оно совсем отсутствует у дрозофилы, дрожжей и нематоды C. elegans?. Нормальное развитие млекопитающих невозможно без метилирования, Если нокаутировать ген метилтрансферазы, осуществляющей метилирование, развитие эмбриона останавливается на ранних стадиях. В то же время метилирование представляет опасность, так как метилцитозин может дезаминироваться и превращаться в тимин. Таким образом, при репликации ДНК вместо пары ГЦ будет AT. Известно, что такие мутации вызывают заболевания - фенилкетонурию, тяжелый комбинированный иммунодефицит, гемофилию и др. Примерно у половины больных гемофилией мутации не наследуются от родителей, а возникают заново в течение жизни. Превращение метилированного цитозина в тимин, а следовательно накопление мутаций, происходит при старении. Однако в процессе дифференцировки клеток этот способ регуляции активности генов носит скорее вспомогательный характер и используется для закрепления выбранного пути развития клетки.
ДНК неактивных генов метилирована в большей степени, чем активных. Метилирование привлекает белки, подавляющие транскрипцию. Метилирование интрона, наоборот, может активировать ген. В процессе образования гамет рисунок метилирования стирается и устанавливается новый - один, характерный для гена в сперматозоиде, другой - для того же гена в яйцеклетке. Может случиться так, что ген, пришедший в зиготу от отца, сильнее метилирован и, следовательно, неактивен. Другими словами, гены эукариот способны сохранять память о том, в составе какого генотипа они пребывали, и соответственно химически модифицироваться, изменяя характер своей экспрессии.

+Аа х >Аа +Аа х >А*а
(нет импринтинга) (есть импринтинг)

+

>
А
а +

>
А
а
А

АА
Аа
А*

А*А
А*а
а

Аа
аа
а*

Аа*
Аа*

3 А• : 1 аа
1 А• : 1 аа
А* - доминантный ген, импринтированный в мужских гаметах. В этом случае фенотип потомка с генотипом А*а не будет отличаться от фенотипа потомка с генотипом аа, так как доминантный ген, полученный от отца проявляться не будет, он выключен.

Рис. 40. Импринтинг

Это явление называется импринтингом, что обозначает след, запечатление. Предположим, в гетерозиготе самцовый ген метилирован, поэтому мутация в нем может не проявляться. Если же мутация в гене самочьем, а он слабо метилирован, проявится заболевания. У человека много импринтированных генов. Реципрокные гибриды по импринтированным генам, вопреки генетической догме, неидентичны. Значит, некоторые гены несут отпечатки пола родителей (рис. 40). В настоящее время есть методы, позволяющие получить мышей, у которых пара гомологичных хромосом от одного родителя. Если, например, 11 хромосома от матери, мыши очень маленькие, если от отца - очень большие. У человека шизофрения и псориаз протекают очень тяжело, если передаются по отцовской линии;поликистоз почек и эпилепсия, наоборот, предаются по материнской линии.

11.1 Посттранскрипционный уровень регуляции активности генов

Многие гены эукариот кодируют различные белки за счет альтернативного сплайсинга мРНК. Другими словами, один и тот же ген может быть матрицей для нескольких белков.
Конститутивная форма альтернативного сплайсинга обусловлена двусмысленностью интрона, когда механизм сплайсинга не может различить две или более альтернативные пары 5' и 3'-сайтов сплайсирования. Поэтому случайно образуются разные формы мРНК. Это характерно для наследственного заболевания ?-талассемии. В большинстве же случаев отбор сайтов сплайсинга определяется клеткой, в результате чего образуются тканеспецифические белки.
Замены экзонов, происходящие при альтернативном сплайсинге, приводят к появлению белков, чаще всего обладающих сходными функциями. Однако возможны и такие случаи, когда синтезируются белки с различающимися и даже противоположными свойствами. Предполагают, что выбор сайтов сплайсинга обусловлен связыванием тканеспецифических белков с растущим РНК-транскриптом.
Необходимость транскрибирования ДНК в составе хроматина сильно усложняет транскрипцию у эукариот. Показано, что изменение упаковки ДНК влияет на экспрессию генов. Предполагают, что гены становятся неактивными, если соответствующий участок подвергается суперспирализации, т. е. образованию гетерохроматина. Это подтверждается данными, полученными при изучении инактивации одной из Х-хромосом в клетках млекопитающих. Все клетки женского организма имеют две Х-хромосомы, а мужского - одну Х- и одну Y-хромосому. Предполагают, что двойная доза продуктов генов Х-хромосомы является летальной, поэтому одна Х-хромосома инактивируется. При этом она полностью конденсируется и образует гетерохроматин. Такие конденсированные хромосомы можно увидеть в световом микроскопе. Это так называемые тельца Барра.

Глава 12. МАНИПУЛИРОВАНИЕ ГЕНАМИ И ГЕНОМАМИ

12. 1.Технология рекомбинантных ДНК

Для изучения структуры и функций ДНК классическим подходом является использование генетических методов, которые на основе анализа фенотипов мутантных организмов позволяет судить о функции генов, их местоположении в хромосомах. В последнее время этот подход обогатился набором методов, позволяющих производить детальный анализ генетического материала - это технология рекомбинантных ДНК. Появление этих методов в 70-х годах называют методической революцией в молекулярной биологии. Они позволяют вырезать определенные участки ДНК, получать практически неограниченное число их копий, определять последовательность нуклеотидов в них, изменять по желанию экспериментатора выделенный ген и вводить его в геном вируса, бактерии или эукариотической клетки, где этот ген начнет функционировать. Техника рекомбинантных ДНК оказала существенное влияние на фундаментальную биологическую науку, позволяя решать задачи, которые раньше представлялись неразрешимыми. Применение этих методов в биотехнологии позволяет получать труднодоступные биологические вещества в виде лекарственных препаратов, новые штаммы полезных бактерий, трансгенные растения и животные.
Расщепление ДНК рестриктазами. Это первый этап на пути выделения гена. Рестриктазы - это класс бактериальных ферментов, опознающих определенные последовательности нуклеотидов в двуспиральной ДНК и разрезающие ее в этих сайтах. В настоящее время производится более 100 рестриктаз, распознающих разные сайты. В качестве отступления необходимо заметить, что бактерии используют рестриктазы как средство защиты от вторжения чужеродных молекул ДНК, например, фаговой. При этом геном бактерии защищен метилированием нуклеотидов в сайтах рестрикции. Комбинация рестриктаз позволяет разрезать ДНК в строго установленных местах с хирургической точностью, с образованием заданных фрагментов (Рис. 41). Рестрикционные фрагменты ДНК уникальны у каждого человека. Поэтому, проведя их электрофорез в геле, можно получить картинку, напоминающую товарный код. По ней можно устанавливать отцовство, материнство и дальнее родство.

Рис. 41. Действие разных рестриктаз на ДНК. Образование липких концов.

Клонирование ДНК. Многие рестриктазы производят разрезание в двуцепочечной ДНК со смещением в несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются одноцепочечные участки. Их называют липкими концами, так как они могут образовывать комплементарные пары с одноцепочечными участками другого фрагмента. Таким образом любой фрагмент ДНК можно воссоединить, включить в другую ДНК, например, вируса или плазмиды и др. Клон - это множество копий идентичных одному предшественнику. Схема клонирования гетерологичной ДНК в плазмиде представлена на рис. 42. Для получения клона ДНК можно использовать также бактериофаги, которые могут принять фрагмент чужеродной ДНК. Чаще всего для этой цели используют ДНК фага ?.

Рис. 42. Клонирование эукариотической ДНК в плазмиде бактерий.

Центральная часть его ДНК может быть заменена фрагментом в 15-20 т.п.н. без ущерба для репликации такого рекомбинантного фага в клетках E.coli. Дале E.coli заражают фагами с фрагментом, например, человеческой ДНК, так что одна E.coli заражается одним рекомбинантным фагом; при размножении она будет нарабатывать фрагмент человеческой ДНК.
Таким образом получают полное собрание генома человека, распределенное по отдельным томам рекомбинантных молекул фаговых частиц в суперобложке бактерии E.coli. Это и есть геномная библиотека. E.coli, зараженные фагом, высевают на питательную среду. Неинфицированные клетки растут, образуя "газон", а инфицированные фагом - лизируются с образованием пятна лизиса, или бляшки. Каждая бляшка содержит множество копий фага с одним фрагментом ДНК человека. Теперь надо отобрать бляшки с нужным фрагментом ДНК. Это делатся с помощью ДНК-зонда, т.е. короткой последовательности в гене человека. Далее только этот фаг с нужным фрагментом размножают в E.coli.
Клонирование кДНК. Если клонирование геномной ДНК предполагает получение клонов ДНК, не зависимо от того, есть в ней гены или нет, то клонировние кДНК направлено на получение генов. Для этого сначала из клеток, в которых интересующий ген экспрессируется достаточно интенсивно, выделяют мРНК. Она, как известно, после созревания не содержит интронов. Затем in vitro производят ее копирование с помощью обратной вирусной транскриптазы (открыта в 1970 г. Г. Темином и Д.Балтимором) в однонитевую ДНК, а потом к ней достраивают вторую комплементарную цепь. Клонирование полученной ДНК осуществляют, как описано выше. Получается библиотека кДНК или генов. Такой метод применяют для получения так называемых одноцепочечных антител. Схема метода представлена на рис. 43. Сначала получают кДНК для VH- и VL-доменов антител и сшивают эти фрагменты ДНК. После трансфекции E.сoli этой ДНК и заражения нитчатым фагом трансфецированные бактерии размножают. В результате образуется множество нитчатых фагов, которые на своей поверхности экспрессируют V-домены антител человека.

Рис. 43. Получение антител человека с помощью нитчатых фагов.

Секвенирование ДНК. Это определение последовательностей нуклеотидов в ДНК. Существует два метода секвенировния. Один из них химический метод Максама-Гилберта, другой основан на репликации ДНК метод Сэнгера. Во избежание излишнего усложнения учебного пособия, мы здесь не описываем эти методы.
Амплификация сегментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 44). Для проведения ПЦР достаточно небольшого количества ДНК (из нескольких клеток). Метод прост и изящен, но для его осуществления надо знать нуклеотидную последовательность амплифицируемой ДНК, чтобы синтезировть два олигонуклеотида - праймера, каждый из которых комплементарен участку одной из цепей

Рис. 44. Проведение полимеразной цепной реакции.

ДНК, примыкающему к выбранному для амплификации сегменту. Сначала ДНК нагревают для разделения дуплекса и копируют. Вновь образовавшиеся дуплексы опять разделяют нагреванаием и проводят следующий раунд амплификации. В ПЦР используют фермент ДНК-полимеразу термофильных архей - Taq- или Pfu- полимеразы. В ПЦР можно амплифицировать фрагменты ДНК длиной до 35 тысяч п.н.
Применение этих и других методов сделало возможным выделение и анализ структуры и функции любого гена.
Выдающимся достижением современной генетики является создание способов направленной модификации геномов животных, растений и микроорганизмов. Имеется в виду рукотворное направленное воздействие на геном - изменение структуры генов, введение в геном чужеродных генов в виде природных или искусственно созданных генных конструкций, а также конструирование новых, доселе не существовавших в природе геномов. В 1982 году создан Международный центр по генной инженерии и биотехнологии, объединяющий 32 государства.
Началось все с трансгенеза, т.е. с переноса генов из одного организма в другой. Основанием для этого послужила разработка методов молекулярной биологии гена, позволяющих выделять определенный ген, получать необходимое число его копий, т.е. клонировать, осуществлять кройку-шитье генов, т.е. убирать ненужные участки и пришивать новые, а также техника рекомбинантных ДНК, позволяющая помещать гены в реплицирующийся вектор - вирус или плазмиду - для дальнейшего переноса в другой организм.
В настоящее время трансгенез превратился в стратегическое направление исследований, дающее ответы на многие фундаментальные и прикладные вопросы. С помощью трансгенеза создают новые породы животных, сорта растений и штаммы микроорганизмов. Трансгены можно вводить в соматические клетки, в оплодотворенную яйцеклетку, а также в стволовые эмбриональные клетки, культивируемые in vitro.
Методы введения генов разнообразны и выбор их зависит от клеток, которые подвергаются трансгенезу. Введение в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки осуществляют непосредственной инъекцией генетической конструкции с использованием микроманипулятора. Таким способом получают трансгенных животных. В стволовые эмбриональные клетки трансгены вводят с помощью вирусной инфекции или электропорации. Затем модифицированные таким образом клетки вводят в бластоцисту мыши, которую трансплантируют в матку ложнобеременной самки. При успешном исходе получается химерная мышь, содержащая трансгенные клетки в разных тканях, в том числе и в зародышевом пути. Трансгенез соматических клеток используют как основной прием в генной терапии. Но об этом несколько позже.

12. 2. Генетическая инженерия

В 1972 году американский ученый Пол Берг опубликовал сообщение о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов ДНК вируса и бактерии. Так, развитие технологии рекомбинантных ДНК ознаменовало рождение новой отрасли молекулярной биологии - генетической инженерии. Задачи этого направления исследований разнообразны. Во-первых, это изучение механизмов функционирования генетического материала эукариот, включая человека. Во-вторых, практические задачи, многие из которых уже сейчас успешно решены. На основе переноса искусственно созданных генетических конструкций в разные организмы получены трансгенные микроорганизмы, растения и животные. Разработаны методы создания новых диагностикумов для выявления наследственных и вирусных заболеваний. В медицине в связи с успехами генной инженерии появилась генная терапия, основанная на введении в организм больного новой генетической конструкции. Генная инженерия индуцировала развитие таких направлений, как генная археология, генная дактилоскопия и т.д. Предпосылками к возникновению генной инженерии были три группы важнейших открытий:
открытие структуры и функции генетического аппарата клетки;
открытие механизмов рекомбинации ДНК - гомологичной и негомологичной;
обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых ДНК, плазмид, способных к репликации и выделяющихся из бактерий в нативном виде;
открытие рестриктаз, бактериальных ферментов, способных расщеплять ДНК в строго определенных местах с образованием фрагментов с липкими концами.
Из этого перечисления открытий видно, что главным теоретическим принципом генной инженерии является генетическая рекомбинация, которая в естественных условиях постоянно осуществляется в организмах. Однако в природе существует много ограничений на рекомбинацию между участками ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит только между гомологичными хромосомами при скрещивании близкородственных организмов. Нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме, поэтому нельзя предугадать, какое получится потомство при скрещивании, и результаты часто бывают прямо противоположными ожидаемым. Эти обстоятельства делают путь к получению новой породы животных или нового сорта растений классическими методами селекции долгим, тернистым и зачастую малоуспешным.
Сущность генной инженерии заключается в том, что процесс рекомбинации производится вне организма, при этом преодолеваются все препятствия, с которыми сталкиваются ученые при классической селекции. В результате появились неограниченные возможности скрещивать гены видов, далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице. Появилась возможность управлять процессом рекомбинации, так как in vitro он не защищен запрещающими механизмами организма. И, наконец, можно предсказывать результат.
Как же получают необходимую рекомбинантную ДНК? Для этого используют вирусы или плазмиды. Сначала получают фрагмент гетерологичной ДНК, например, эукариотической и плазмидной с одинаковыми липкими концами. Для этого ту и другую ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой. В результате одноцепочечный липкий конец одного фрагмента оказывается комплиментарным концу другого фрагмента. Гибридизацию фрагментов проводят in vitro, а затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку. Обычно используемая плазмида имеет маркерный ген, придающий бактерии устойчивость к антибиотику. Поэтому бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды, будут расти на среде с добавлением этого антибиотика, а все другие погибнут. Рекомбинантная плазмида начинает функционировать, т. е. ее ДНК реплицируется и транскрибируется. В результате в бактериальной клетке появляется белок, которого никогда в этих клетках в естественных условиях не было. Таким способом можно ввести любой ген в любую клетку.
Итак, основные процедуры генной инженерии сводятся к следующим:
рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНК-гена;
введение рекомбинантной ДНК в вирус или плазмиду;
получение клона клеток, экспрессирующих данный ген.

12.3. Трансгенные микроорганизмы

Первыми организмами, которые по воле ученых содержали рекомбинантную ДНК, явились бактерии, а именно E. сoli, производящие генно-инженерный человеческий инсулин. Инсулин - гормон поджелудочной железы - играет главную роль в углеводном обмене. Если он не производится в организме (по разным причинам), развивается тяжелое заболевание - диабет. Для лечения больных диабетом применяли инъекции свиного инсулина, на который у многих больных развивалась иммунологическая реакция. Но даже потребности в свином инсулине удовлетворялись всего на 60%. Поэтому в качестве первой практической задачи генные инженеры клонировали ген человеческого инсулина и включили его в плазмиду, которой заразили E.coli (рис. 45). В результате E.coli. стали нарабатывать человеческий инсулин. За ночь каждая бактерия дает потомство 107 клеток. Из 1000 л бактериальной культуры получают 200 г инсулина, столько же, сколько получали раньше из 1600 кг поджелудочной железы свиней. Главное, для этих больных решена проблема иммунологической реактивности на чужеродный свиной инсулин.
Другой генно-инженерный биопрепарат - это интерферон, который успешно применяют для лечения вирусных заболеваний и злокачественных опухолей. В настоящее время на стадии клинического испытания находится более 1000 генно-инженерных лекарственных веществ. Около 200 новых диагностических препаратов уже введено в медицинскую практику. Так начало развиваться одно из главных направлений в генной инженерии - наработка труднодоступных лекарственных биопрепаратов - гормонов, факторов роста, нейро- и иммуномодуляторов, аминокислот, витаминов, антибиотиков. Второе направление - это получение рекомбинантных вакцин для профилактики инфекционных заболеваний. Идеалом является комбинированная вакцина, состоящая из иммунодоминантных эпитопов ряда возбудителей ( что в естественных условиях не встречается), эффективная при использовании в малой дозе для перорального введения людям и сельскохозяйственным животным.
В пищевой промышленности используются трансгенные штаммы организмов в хлебопечении, сыроварении, получении кисломолочных продуктов, виноделии и т.д.

Рис. 45 . Получение генноинженерного инсулина.

<< Пред. стр. 4 (из 6) След. >>

Список литературы по разделу