Механизмы устойчивости опухолей к цисплатину

ЗМРЖСТ

1. Транспорт цисплатина 2

2. Внутрiшньоклiтинна мiшень цисплатина 4

3. Вплив цисплатина на клiтинний цикл та iндукцiя апоптозу 5

4. Механiзми резистентностi пухлинних клiтин до цисплатина 7

4.1. Механiзми клiтинноi резистентностi на

рiвнi цитоплазматичноi мембрани 7

4.2. Внутрiшньоклiтиннi тiоловi детоксикуючi системи 9

4.2.1. Система глутатiону 9

4.2.2. Металотеонеiни 10

4.3. Репарацiя пошкоджень ДНК 11

4.4. Змiни генома, що асоцiйованi з резистентнiстю

до цисплатина 15

Список використаних джерел 21

Цисплатин i одним з найбiльш загальновживаних препаратiв у лiкуваннi солiдних пухлин людини. Однак ефективне застосування цисплатина у клiнiцi часто лiмiтуiться токсичнiстю препарату та розвитком резистенстностi до нього. Резистентнiсть до цисплатина маi комплексний характер i пов`язана з рядом особливостей пухлинних клiтин, включаючи змiни в проникностi цитоплазматичноi мембрани, пiдвищення активностi детоксикуючих та репаративних систем клiтини, порушення експресii генiв fos, nm23, p53, mdm2, bcl-2 та iншi. Порушення бiохiмiчних сигнальних шляхiв апоптозу також можуть бути основою для розвитку резистентностi. Розумiння молекулярних основ дii цисплатина та механiзмiв розвитку резистентностi до нього дозволять значно покращити результати клiнiчних випробувань препарату.

1.Транспорт цисплатина

Взаiмодiя цисплатина з плазматичною мембраною i першою щаблею багатостадiйного процесу реалiзацii цитотоксичного ефекту препарату. Ступiнь пошкодження мембран цитостатиком залежить вiд текучостi iх лiпiдноi компоненти, яка визначаiться швидкiстю проходження процесiв перекисного окислення лiпiдiв [1].

На сьогоднi iснують двi гiпотези поглинання препарату пухлинною клiтиною. Бiльш аргументована гiпотеза пасивного транспорту, основана на фактах вiдсутностi iнгiбування переносу цисплатина за допомогою його структурних аналогiв та проникнення цисплатина в клiтину без насичення до межi його розчинностi у культуральному середовищi [2]. Але ряд вчених вiдстоюi iдею iснування активного транспортера цисплатина. У 1984 роцi був вiдкритий iнгiбiтор синтезу протеiнiв бензальдегiд, який послаблював цитотоксичний ефект цисплатина за рахунок зменшення його накопичення в клiтинi. РЖнший вiдомий iнгiбiтор бiлкового синтезу тАУ циклогексамiд не мав такого ефекту. Це й стало основою для заключення, що бензальдегiд якимось чином безпосередньо реагуi з мембранним бiлком-транспортером, уповiльнюючи таким чином проникнення цисплатина у клiтину [3].

Пiзднiше було знайдено, що альдегiднi похiднi пиридоксаль та пиридоксаль-5-фосфат також значно послаблюють цитотоксичну активнiсть цисплатина. Вiдомо, що цi речовини утворюють основи Шиффа з амiногрупами на поверхнi клiтини. Було показано, що i бензальдегiд i iншi похiднi iнгiбують проникнення цисплатина у клiтину на 50% у порiвняннi з контролем. РД данi про те, що попередня iнкубацiя клiтин з iнгiбiтором Nа/К АТФ-ази уабаiном також зменшуi проникнення цисплатина у клiтину на 50%. Подальшi дослiдження у цьому напрямку показали, що безпосередньо Nа/К АТФ-аза не i транспортером цисплатина, однак транспорт лiкiв Na-залежний, а також залежить вiд мембранного потенцiалу клiтини [4,5].

Розглянемо загальновживану модель акумулювання цисплатина в клiтинi, яка влаштовуi прибiчникiв обох гiпотез. Швидке накопичення половини цисплатина у клiтинi проходить за рахунок пасивноi дифузii, тодi як iнша половина транспортуiться через канали, що закриваються. Якщо активнiсть останнiх заблоковано, то можна очикувати зменшення проникнення цисплатина в клiтину на 50%. Данi про регуляцiю активностi каналiв дозволяють зробити висновок, що проходження цисплатина через них регулюiться каскадом реакцiй фосфорилювання, що iнiцiюються протеiнкiназою А (РКА), протеiнкiназою С (РКС) чи кальмодулiнзалежними кiназами [3]. Здатнiсть мембранонепроникних альдегiдних похiдних блокувати накопичення цисплатина у клiтинi на 50% обумовлюiться реактивнiстю зовнiшнiх амiногруп бiлкiв, що формують такий канал. Той факт, що iнгiбування початкового потоку цисплатина у клiтину на 50% вiдбуваiться за допомогою уабаiна, пiдтверджуi, що повний мембранний градiiнт, зумовлений Na/K АТФ-азою, важливий для роботи каналiв.

Bиведення цисплатина з клiтини тАУ двохфазний процес з дуже короткою почaтковою фазою тривалiстю 5 хв та бiльш довгою кiнцевою фазою [6,7]. Встановлено iснування АТФ-залежного переносника цисплатина кон`югованого з глутатiоном [8,9]. Описана АТФ-залежна глутатiон-S-кон`югат експортуюча помпа (ГS-Х-помпа) , що маi широкий спектр субстратноi специфiчностi та транспортуi органiчнi анiони, лейкотрiiн С₄ та iншi сполуки, що несуть великi гiдрофобнi дiлянки та хоча б два вiд`iмнi заряди. ГS-Х-помпа виводить потенцiйно токсичнi кон`югати глутатiон-S-платина (ГS-Pt) з пухлинних клiтин, таким чином беручи участь в формуваннi резистентностi клiтин до цисплатина [10].

2.Внутрiшньоклiтинна мiшень цисплатина.

Внутрiшньоклiтинною мiшенню цисплатина i ДНК, з якою препарат ковалентно зв`язуiться. Бiфункцiональнi продукти взаiмодii цисплатина з ДНК, що називаються цисплатин-ДНК-адукти, блокують реплiкацiю, транскрипцiю i, як наслiдок, - клiтинну пролiферацiю. Цисплатин дii на 7-му позицiю залишка гуанiна та формуi декiлька типiв адуктiв з основами ДНК. Два основнi адукти це G-G внутрiшньоланцюговi зшивки (складають 60-65% усiх адуктiв), A-G внутрiшньоланцюговi зшивки ( 20-25% усiх адуктiв), а також мiжланцюговi та ДНК-бiлковi зшивки [11]. Пiсля дii цисплатина основна кiлькiсть адуктiв утворюються вже через 6-12 годин [12]. Формування адуктiв вiдбуваiться в два етапи. Спочатку маi мiсце швидкий етап алкiлування: один ланцюг ДНК формуi цисплатин-моноадукт. Далi повiльна фаза: реакцiя з`iднання з другим ланцюгом.

Бiльшiсть робiт у напрямку дослiдження взаiмодii цисплатина та ДНК стосуiться ядерноi ДНК. Але в останнi роки вчених зацiкавила у цьому вiдношеннi мiтохондрiальна ДНК. Виявилось, що ця ДНК у 4-50 разiв (для рiзних модельних систем) бiльш чутлива до пошкоджуючого ефекту цисплатина, нiж ядерна ДНК [13,14]. А у зв`язку з сучасними уявленнями про роль мiтохондрiй у реалiзацii програми апоптозу цей факт набуваi нового значення.

3.Вплив цисплатина на клiтинний цикл та iндукцiя апоптозу.

Вiдомо, що у багатьох модельних системах in vitro цисплатин не э фазоспецифiчним протипухлинним препаратом. Пухлиннi клiтини у рiзних фазах клiтинного циклу однаково чутливi до нього [15]. Але данi деяких дослiджень свiдчать про те, що все таки у фазi G₂/M клiтини i бiльш чутливими до дii цитостатика [16]. Низькi концентрацii цисплатина у клiтинах викликають уповiльнене проходження S-фази i зупинку у G₂/M-фазi клiтинного циклу [17]. В залежностi вiд концентрацii препарату i, вiдповiдно, пошкодження ДНК, клiтина пiсля G₂/M-зупинки вступаi в наступну фазу клiтинного циклу тАУ мiтоз, або входить в апоптоз. Щодо дii цитостатика на регулятори клiтинного циклу, то встановлено, що цисплатин не впливаi на внутрiшньоклiтинний вмiст циклiну А [18]. Але при дii препарату збiльшуються рiвнi циклiну В, p34cdc2 а також зростаi активнiсть гiстон Н1-кiнази [19]. Пiсля дii цисплатина пiдвищуiться експресiя циклiну D1, cdk4, а також збiльшуiться рiвень фосфорилювання бiлка ретинобластоми, тобто з`являються усi ознаки руху клiтини по клiтинному циклу [20]. РЖ дiйсно, якщо обробляти цисплатином клiтини, що знаходяться у станi спокою (G₀), вони виходять у G₁-фазу, повiльно проходять S-фазу i зупиняються у G₂/M-фазi клiтинного циклу.

Пiсля пошкодження ДНК цисплатином у клiтинах вiдбуваiться збiльшення експресii бiлка Р53 i Р53-залежне пiдвищення експресii бiлка р 21, який i спричиняi зупинку клiтинного циклу [21].

Субтокичнi дози цисплатина iндукують загибель клiтин за типом апоптозу, з усiма характерними бiохiмiчними та морфологiчними ознаками процесу: екстерналiзацiiю фосфотидилсерину, активацiiю каспаз, фрагментацiiю ДНК, утворенням апоптичних тiлець [22-24].

В багатьох модельних системах in vitro показано, що лiкарськi протипухлиннi препарати, в тому числi i цисплатин, викликають пiдвищення експресii поверхневого рецептора Fas, що потребуi синтезу бiлка de novo [25], а також його лiганда FasL [26]. Але на сьогоднi вважаiться, що iндукований проитипухлинними лiками апоптоз не i залежним вiд активацii безпосередньо Fas-системи, оскiльки вживання антагонiстичних анти-CD95 моноклональних антитiл не впливало на розвиток апоптозу пiд дiiю цитостатикiв [27].

Особливо цiкавими i данi щодо ефекторних механiзмiв апоптозу, iндукованого цисплатином. Вiдомо, що у цьому процесi бере участь каспаза-3, оскiльки застосування ii iнгiбiторiв бiлка CrmA та Z-VAD-CH2DCB призводить до гальмування апоптозу, спричиненого цитостатиком [28,29]. Каспаза-3 активуi iншi каспази, крiм того розщiпляi фактор iнiцiацii трансляцii 4G (eIF4G), що призводить до гальмування синтезу бiлка [30].

4.Механiзми резистентностi пухлинних клiтин до цисплатина.

4.1.Механiзми клiтинноi резистентностi на рiвнi цитоплазматичноi мембрани

Одним з основних механiзмiв клiтинноi резистентностi до цисплатина розглядають особливостi будови цитоплазматичноi мембрани та прямого та зворотнього транспорту крiзь неi.

Однiiю з особливостей пухлинних клiтин, резистентних до дii цисплатина, i зменшена у порiвняннi з чутливими клiтинами акумуляцiя препарату [31,32].

Дана модель пояснюi, чому так багато клiтинних лiнiй резистентних до дii цисплатина вiдрiзняються зменшеним накопиченням цисплатина. Мутацii, що призводять до змiн структури каналiв чи гiперполяризацii клiтинноi мембрани, можуть спричинити виникнення резистентного клона клiтин.

Нещодавно до клiтин мишиноi лiмфоми R1.1, резистентних до дii цисплатина були одержанi антитiла, якi реагували з глiкопротеiдом з молекулярною масою 200кД, гiперекспресованим на поверхнi цих клiтин. Кiлькiсть бiлка на клiтиннiй поверхнi знаходилась у зворотнiй залежностi вiд акумулювання цисплатина у клiтинах та корелювала з рiвнем iх чутливостi до цисплатина. Було запропоновано, що даний бiлок може бути аналогом Р-глiкопротеiда (Pgp) i i непрацездатним каналом, що гiперекспресований на клiтиннiй поверхнi для компенсацii дефектноi функцii [33].

В резистентних до цисплатина клiтинах з пiдвищеним вмiстом глутатiона часто спостерiгаiться гiперекспресiя ГS-Х-помпи. В цитоплазматичних везикулах таких клiтин знаходиться бiльше кон`югатiв ГS-Pt, нiж в чутливих клiтинах [34]. Така внутрiшньоклiтинна компартменталiзацiя лiкiв та продуктiв iх метаболизму також вважаiться одним з механiзмiв лiкарськоi резистентностi. В багатьох випадках резистентнi пухлиннi клiтини вiдрiзняються розвинутою везикулярною сiткою, що дозволяi iм просторово нейтралiзувати токсини та виводити iх шляхом екзоцитозу.

В експериментах з використанням бутионiнсульфоксимiна (BSO), iнгiбiтора синтезу глутатiона, було показано, що при витощеннi внутрiшньоклiтинного глутатiона активнiсть ГS-Х-помпи лише трохи зменшуiться [35]. Таким чином, ефективнiсть транспорту ГS-Pt-кон`югатiв визначаiться не тiльки концентрацiiю останнiх, а й експресiiю переносника.

Останнiм часом з`явилися роботи, що засвiдчують, що бiлок, асоцiйований з загальною лiкарською резистентнiстю (MRP але не Pgp) може функцiонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гiпотеза пiдтверджуiться такими фактами: 1) клiтини, що гiперекспресують MRP секретують у культуральне середовище бiльше глутатiона; 2) витощення внутрiшньоклiтинного глутатiона за допомогою BSO запобiгаi виведенню лiкiв з клiтин за допомогою MRP; 3) гiперекспресiя MRP вiдповiдаi пiдсиленому АТФ-залежному транспорту кон`югатiв ГS-Х; 4) антитiла до MRP реагують з бiлком з молекулярною масою 190 кД, який може зв`язуватись з ГS-кон`югатами та лейкотрiiном С₄.

Таким чином, видалення з клiтин комплексiв глутатiон-S-платина переносниками з активнiстю ГS-Х-помпи i важливим механiзмом резистентностi, завдяки якому внутрiшньоклiтинна концентрацiя препарату пiдтримуiться на низькому рiвнi, що сприяi зменшенню його пошкоджуючого ефекту.

4.2.Внутрiшньоклiтиннi тiоловi детоксикуючi системи

4.2.1. Система глутатiона

Глутатiон та ферменти його метаболiзму i важливими елементами меxанiзму резистентностi клiтин до алкiлуючих агентiв, в тому числi сполук платини.

Бiльшiсть клiтинних лiнiй, резистентних до дii цисплатина вiдрiзняються пiдвищеним вмiстом внутрiшньоклiтинного глутатiона та/чи гiпреактивнiстю фермента, що iнiцiюi синтез глутатiона g-глутамiлцистеiнсинтетази (g-ГЦС) [38-40]. Однак описанi приклади стiйких до дii цисплатина клiтинних лiнiй з нормальним [41,42] та зниженим [43] у порiвняннi з чутливими лiнiями вмiстом глутатiона.

Сучаснi стереоскопiчнi та спректроскопiчнi методи дозволили визначити, що глутатiон та цисплатин реагують безпосередньо у безклiтиннiй системi в молярному спiввiдношеннi 2/1, утворюючи хелатний комплекс диглутатiонплатини. Пiсля 12 годин iнкубацii клiтин в середовищi з цисплатином концентрацiя ГS-Pt-кон`югатiв стаi максимальною. При цьому 60% внутрiшньоклiтинноi платини знаходиться у зв`язаному станi [10].

Заслуговують на увагу данi, отриманi в експериментах з використанням iнгiбiтора синтезу глутатiона бутiонiнсульфоксимiна (BSO). Обробка BSO клiтинних лiнiй раку шлунка людини MKN-28 та MKN-45 , раку яiчника КК та МН, аденокарциноми ротовоi порожнини КВ призводить до сенсибiлiзацii клiтин до дii цисплатина [44,45]. Причому витощення внутрiшньоклiтинного глутатiона за допомогою BSO не впливало на акумулювання цисплатина в клiтинах а також формування кон`югатiв GSH-Pt [46].

При вивчeннi взаiмодii ферментiв метаболiзму глутатiона та iх ролi в механiзмах резистентностi велике значення мають експерименти з використанням культур клiтин, трансфекованих генами вiдповiдних ензимiв. Наприклад, клiтини раку легенiв людини, трансфекованi геном фермента g-ГЦС, мають у 2 рази бiльше глутатiона, в 1,6 рази пiдвищену активнiсть ГS-Х-помпи та в 1,5 рази меньшу акумуляцiю цисплатина, в 6,7 рази бiльшу резистентнiсть до цисплатина у порiвняннi з батькiвською клiтинною лiнiiю. Витощення внутрiшньоклiтинного глутатiона в трансфектах за допомогою BSO не впливало на резистентнiсть до цисплатина. У таких випадках зберiглась висока активнiсть ГS-X-помпи i тому внутрiшньоклiтинна концентрацiя платини не змiнилася. Таким чином, в данiй клiтиннiй системi резистентнiсть обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-конюгатiв за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своii активностi навiть при витощеннi субстрата (глутатiона) [47].

В той же час не винайдено нiякого зв`язку мiж рiвнем експресii глутатiонредуктази та глутатiонпероксидази та ступенем стiйкостi клiтин до дii цисплатина [48,49].

4.2.2.Металотеонеiни

Особлива роль у формуваннi резистентностi вiдводиться металотеонеiнам.

Оскiльки у вiльному станi цi сполуки нуклеофiльнi, металотеонеiни зв`язуються з електрофiльними протипухлинними препаратами типу цисплатина, а також мелфаланом та деякими антибiотиками: адрiамiцином, блеомiцином та доксорубiцином.

Клiтини, що гiперексперсують металотеонеiни, часто резистентнi до дii цисплатина [50,51]. Однак металотеонеiн не i обов`язковим компонентом резистентностi до цього препарату, оскiльки зустрiчаються резистентнi до цисплатина клiтиннi лiнii, в яких металотеонеiн не виявляiться [43].

При обробцi цисплатином резистентних до препарата клiтин з пiдвищеним вмiстом металотеонеiна 70% внутрiшньоклiтинноi платини знаходять у зв`язаному з бiлком станi.

Дослiди по трансфекцii гена металотеонеiна РЖРЖа показали, що клiтини-трансфекти набувають резистентностi до цисплатина, хлорамбуцила та мелфалана [52].

Добре виражена експресiя металотеонеiна в пухлинах може мати прогностичне значення. Наприклад, при лiкування хворих на рак стравоходу за допомогою цисплатина 5-рiчна життiздатнiсть пацiiнтiв з металотеонеiн-вiд`iмними пухлинами становить 56%, а пацiiнтiв з металотеонеiн-позитивними пухлинами тАУ 26% [53].

З наведених вище даних можна заключити, що у випадках пiдвищеноi експресii металотеонеiн i важливою складовою резистентностi до цисплатина.

4.3.Репарацiя пошкоджень ДНК.

Резистентнiсть клiтин до дii цисплатина може залежати вiд стану системи репарацii пошкоджень ДНК.

Один з механiзмiв резистентностi клiтин до цисплатину тАУ прискорена репарацiя цисплатин-ДНК-адуктiв [54]. Чутливi до дii цисплатина клiтиннi лiнii вiдрiзняються зниженою здатнiстю лiквiдувати основнi адукти ДНК та цисплатина (GG-Pt та GA-Pt), а також послабленою активнiстю ДНК-полiмераз [55,56]. Обробка резистентних до цисплатина клiтин афiдикоiном тАУ iнгiбiтором ДНК-полiмераз a та b повертаi чутливiсть до цисплатина, що стверджуi роль репарацii адуктiв цисплатин-ДНК у формуваннi резистентностi [57].

На сьогоднi мало вiдомо, щодо лiквiдацii продуктiв платинування ДНК у мiтохондрiях. Вважають, що мiтохондрiальна ендонуклеаза G (Endo G) може брати участь у репаративних процесах цих органел [58].

Нещодавно з культуральноi рiдини пухлинних клiтин та бiопсiйного матерiалу пухлин людини були видiленi бiлки HMG (high-mobility group) та iм подiбнi, якi зв`язуються з ДНК, що пошкоджена цисплатином, але не трансплатином чи ультрафiолетовим випромiненням [59,60]. Цi бiлки тАУ висококонсервативнi, локалiзуються у цитоплазмi та ядрi клiтини. РЗх бiологiчна роль ще точно не встановлена. РЖнтенсивнiсть зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подiбними бiлками прямо пропорцiйна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клiтин зв`язуiться з цими бiлками бiльш ефективно. HMG-бiлки взаiмодiють з платинованою ДНК, закривають пошкодженi сайти вiд ферментiв ексцизiйноi репарацii. Припускають, що зв`язування HMG-подiбних бiлкiв з пошкодженою ДНК може викликати зупинку реплiкацii чи транскрипцii, а також впливати на роботу систем контролю клiтинного циклу при руйнуваннi ДНК.

Вiдомо, що такi дефекти системи репарацii невiдповiдностей (mismatch repair), як недостатня експресiя бiлкiв hMSH2 чи hMLH-1, призводять до виникнення резистентностi до цисплатина [61,62]. MSH2-бiлок сам по собi чи разом з бiлком GTBP/p160 розпiзнаi невеликi змiни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти платинування ДНК, i зв`язуiться з ними.

Априорi можна було б припустити, що вiдсутнiсть якоi-небудь частини системи репарацii ДНК сприяi розвитку гiперчутливостi до дii цисплатина, що вiдбуваiться у клiтинах, дефектних за системою ексцизiйноi репарацii. Але у випадку порушення функцii системи mismatch repair клiтина набуваi резистентностi до цисплатина. Цей феномен можна розглядати з двох позицiй. По-перше, порушення системи mismatch repair може бути наслiдком iндукованого цисплатином випадкового мутагенезу, що в результатi обумовлюi стiйкiсть до дii цисплатина. По-друге, саме дефект у роботi цiii системи репарацii може покласти початок резистентностi [63,64].

Комплекс бiлкiв репарацii тАЬрозпiзнаiтАЭ адукти у ланцюгу-шаблонi ДНК та намагаiться виправити ланцюг, що синтезуiться [65]. Так, поки iснуi адукт у ланцюгу-шаблонi, а пiдбiр нових основ не лiквiдуi невiдповiднiсть, що iснуi, генеруiться сигнал, який запускаi програму апоптозу. Якщо система mismatch repair не працюi, такий сигнал не генеруiться, клiтини стають толерантними до адуктiв цисплатин-ДНК та набувають резистентного фенотипу.

У випадку порушення системи ексцизiйноi репарацii спостерiгаiться протилежний ефект. Клiтини, дефектнi по системi ексцизiйноi репарацii значно бiльш чутливi до дii цисплатина, нiж нормальнi клiтини [66].

Показано, що цисплатин iндукуi експресiю важливого для ексцизiйноi репарацii гена ERCC-1. Але до активацii гена ERCC-1 вiдбуваiться активацii генiв c-fos та c-jun, а також фосфорилювання бiлка c-Jun [67].

Нещодавно був вiдкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацiiю пошкодженоi ДНК. Показано, що гiперекспресiя цього гена в клiтинах рака яiчника та молочноi залози асоцiйована з резистентнiстю до дii цисплатина [68].

Топоiзомерази РЖ та РЖРЖ, що релаксують спiралi ДНК, i важливими ферментами реплiкацii, транскрипцii та рекомбiнацii. Вони вiдiграють суттiву роль у процесах усунення адуктiв ДНК-цисплатин. У багатьох резистентних до дii цисплатина клiтинах спостерiгаiться пiдвищена активнiсть топоiзомерази РЖРЖ [69]. РЖнгiбiтори топоiзомераз РЖ та РЖРЖ: етопозид, камтотецин, СРТ-11, SN-38, новобiоцин тАУ викликають сенсибiлiзацiю резистентних клiтин до дii цисплатина [70-72].

Ще одним механiзмом резистентностi до цисплатина на рiвнi ДНК може бути пiдвищена концентрацiя в клiтинi вiльних нуклеотидiв (наприклад, АТФ, АДФ), якi конкурують з ДНК за зв`язування з цисплатином [73]. Таким чином, вiльнi нуклеотиди, концентрацiя яких у цитоплазмi вiдрiзняiться в рiзних клiтинах, можуть значно впливати на чутливiсть пухлин до цисплатина.

Важливо також розглянути утворення зшивок ДНК-бiлок пiд дiiю цисплатина. Хоча кiлькiсть цих адуктiв набагато менше, нiж у разi мiж- та внутри- ланцюгових зшивок, але вiдмiчено, що вони також вiдповiдальнi за цитотоксичний ефект цисплатина. Наприклад, було показано, що одна резистентна до дii цисплатина клiтинна лiнiя раку яiчника утримувала у 6 разiв менше цитокератина 18, нiж чутлива лiнiя. Трансфекцiя кДНК цитокератина 18 в клiтини резистентноi лiнii давала клони з пiдвищеним рiвнем цього бiлка та у бiльшостi випадкiв з чутливим фенотипом. При цьому було встановлено, що пiсля обробки цисплатином, з ДНК у клiтинах зв`язуються негiстоновi бiлки. Пiзнiше цi бiлки було iдентифiковано як цитокератини [74]. Можливо, що формування зшивок цитокератин-ДНК, асоцiюiться з цитотоксичнiстю цисплатина. Тодi зменшення продукцii цитокератина 18 у резистентних клiтинах веде до зменшення кiлькостi зшивок бiлок-ДНК та, як наслiдок, зниження чутливостi до цисплатина.

Виходячи з вищенаведеного, можна заключити, що резистентнiсть до дii цисплатина на рiвнi ДНК обумовлена пiдвищеною активнiстю систем репарацii клiтини чи ii толерантнiстю до iснуючих ДНК-Pt-адуктiв.

4.4.Змiни генома, що асоцiйованi з резистентнiстю до цисплатина.

Оскiльки клiтинна резистентнiсть i стiйко спадковою ознакою в ряду поколiнь, можна зробити висновок, що стiйкiсть до дii цисплатина визначаiться генетичними особливостями клiтини.

Встановлено, що основна роль в цьому феноменi належить 11-й та 16-й хромосомам у людини [75]. На клiтинних гiбридах з рiзним хромосомним складом було показано, що обовязковою умовою резистентного фенотипа i наявнiсть 16-i хромосоми з резистентних клiтин та 11-i хромосоми з чутливих клiтин. При цьому основну роль граi 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхiдна для ii нормального функцiонування. Цi хромосоми залученi у рiзнi боки резистентностi. На 16-тiй хромосомi присутнi гени MRP (multidrug resistance associated protein), LRP (lung resistance protein), гени додаткового бiлка ексцизiйноi репарацii-4, металотеонеiна. На 11-iй хромосомi розташованi гени, що кодують глутатiон трансферазу p (ГSТ-p), а також протеiн, що розпiзнаi специфiчнi послiдовностi пошкодженоi ДНК.

Чутливiсть пухлинних клiтин до дii цисплатина може залежати вiд функцiональноi активностi генiв р 53 та генiв родини bcl.

На сьогоднi все ще залишаiться вiдкритим питання про зв`язок лiкарськоi резистентностi з р 53-статусом клiтин. Невизначенiсть тут iснуi тому, що роль бiлка Р 53 у хемочутливостi клiтин до лiкарськоi терапii розглядають з двох протилежних точок зору: 1) експресiя бiлка Р 53 дикого типу (wt p 53) збiльшуi чутливiсть до хiмiотерапii шляхом прискорення входження клiтин в апоптоз; 2) бiлок wt P 53 зменшуi хемочутливiсть, оскiльки пiсля пошкодження ДНК обумовлюi зупинку росту для репарацii ДНК [76].

Вiдомо, що пiсля дii цисплатина у чутливих клiтинах збiльшуiться рiвень експресii гена р 53 та вiдповiдно тАУ бiлка Р 53. Р 53 iндукуi експресiю бiлка р 21/WAF1/CIP1-iнгiбiтора циклiн залежних кiназ, що граi важливу роль у зупинцi клiтинного циклу у G₁-фазi пiсля генотоксичного стресу [77,78]. Пiд час цiii зупинки клiтиною приймаiться тАЬрiшеннятАЭ: репарувати ДНК чи входити в апоптоз, в залежностi вiд глибини пошкодження. На сьогоднi ще невiдомi усi бiохiмiчнi подробицi того, як активацiя р 53 iнiцiюi апоптоз.

Бiльшiсть робiт по вивченню функцiональноi активностi Р 53 у резистентних до дii цисплатина клiтинах засвiдчують, що мутацii гена р 53 призводять до розвитку резистентностi до хiмiотерапii [79-82]. Показано, що в резистентних клiтинах часто порушена внутрiшньоклiтинна локалiзацiя бiлка Р 53 [83] а також не вiдбуваiться iндукцiя експресii Р 53 та р 21 цисплатином [84,85]. Дослiди по трансфекцii гена р 53 також довели, що перенос у дефектнi за функцiiю Р 53 чи null-клiтини wt p53-гена обумовлюi збiльшення чутливостi до лiкарських препаратiв, а трансфекцiя мутантного гена mut p 53 спричиняi розвиток резистентностi [86].

Дослiджено, що в клiтинi пiсля дii цисплатина разом з р 53 iндукуiться експресiя гена mdm 2. Продукт даного гена вiдрiзняiться властивiстю утворювати комплекси з бiлком Р 53 , таким чином дезактивуючи частину внутрiшньоклiтинного Р 53. В резистентних до цисплатина клiтинах iнодi спостерiгаiться гiперекспресiя гена mdm 2 [87] а використання антисмислових (проти mdm 2) нуклеотидiв у такiй системi призводить до збiльшення чутливостi до лiкарськоi терапii [88].

Таким чином, функцiя Р 53 може бути iнактивована двома шляхами: мутацiями безпосередньо гена р 53 а також пiдвищеним комплексоутворенням Р 53 з MDM 2.

Але данi деяких дослiджень заперечують, що мутацii р 53 обов`язково спричиняють розвиток лiкарськоi резистентностi. Feudis з спiвавторами показали, наприклад, на 9 клiтинних лiнiях раку яiчника з рiзним р 53- статусом, що в цих клiтинних лiнiях пiсля обробки цисплатином рiвень експерсii р 21 пiдвищуiться однаковo i немаi рiзницi у чутливостi до апоптозу, iндукованого дiiю препарата [89,90].

Однак вiдомо, що бiльш половини злоякiсних новоутворень людини вiдрiзняються мутацiями р 53, i ця ознака i важливим показником чутливостi пухлин до хiмiотерапii [91]. У клiнiчних дослiдженнях показано, що рiвень експресii р 53 у зразках бiопсiйного матерiала при раку шлунка та яiчникiв може бути важливим прогностичним показником захворювання [92]. Дослiджено, що Р 53-позитивний фенотип пухлин асоцiюiться з поганим прогнозом [93,94]. Це пояснюiться тим, що мутантна форма бiлка маi подовшений час напiвжиття i тому легше виявляiться iмуногiстохiмiчно.

Бiлки родини Bcl (Bcl-2, Bcl-X_l, Bcl-X_s, Bax та iншi) грають важливу роль у регуляцii процесу апоптоза. Деякi з них (Bcl-X_l, Bcl-2) гальмують розвиток апоптоза, тодi як iншi (Bcl-Xs, Bax, Bak) тАУ навпаки i промоторами цього процесу. Вiдомо, що бiлки даноi родини здатнi гетеродимеризуватись, утворюючи умовний тАЬреостаттАЭ, який регулюi функцiональну активнiсть бiлкiв [95]. Дослiджено, що бiлки Bcl-2 та Bcl-X_l гiперекспресованi при багатьох неопластичних захворюваннях людини. Причому така гiпрекспресiя асоцiйована з резистентнiстю пухлинних клiтин in vitro до протипухлинних препаратiв [96]. Така стiйкiсть клiтин пов`язана з порушенням механiзмiв iндукцii апоптозу у вiдповiдь на лiкарську терапiю. У дослiдах з використанням клiтин траксфекованих генами bcl-2 чи bcl-x_l було показано, що трансфекти набувають резистентний фенотип до цiлого ряду лiкарськиi препаратiв включаючи цисплатин [97,98]. У таких модельних клiтинах була значно зменшена деградацiя ДНК пiсля обробки цисплатином. Якщо порiвнювати внесок продуктiв генiв bcl-2 та bcl-xl у антиапоптозному ефектi, то показано, що бiлок Bcl-X_l маi бiльший вплив [99].

Пiсля обробки цисплатином у чутливих клiтинах, що входять в апоптоз, не змiнюiться рiвень експресii бiлкiв Bcl-2, Bcl-X_l та Bax (24kDa), але пiдвищуiться рiвень бiлкiв Bak та Bax (21 kDa), тобто бiлкiв-агонiстiв апоптозау [100-102]. Вiдомо, що в деяких резистентних до цисплатина клiтинних лiнiях спостерiгаiться знижений рiвень експресii Bax [103], а трансфекцiя гена bax спричиняi пiдвищення чутливостi до хiмiотерапii [104]. А от клiтини з пiдвищеною експресiiю Bak вiдрiзняються бiльшою чутливiстю до дii цисплатина [105].

Вiдомо, що бiлок Bcl-2 часто гiперекспресований у пухлинах людини. Причиною такоi гiперекспресii вважають частi дiлецii великих нетрансльованих послiдовностей з 3 та 5 тАУ кiнцiв гену bcl-2 (78-А). Дещо суперечливi данi iмуногiстохiмiчних дослiджень експресii бiлкiв родини Bcl у зразках бiопсiйного матерiалу та прогнозування чутливостi до лiкарськоi терапii у порiвняннi з дослiдженнями in vivo. Наприклад, однi дослiдники повiдомляють, що Вcl-2-позитивнi неоплазii мають слабку вiдповiдь на хiмiотерапiю та поганий прогноз [106,107], iншi тАУ навпаки, спостерiгають, що експресiя Вcl-2 у пухлинах асоцiюiться з покращеним виживанням [108]. Експресiя Вax окремо не маi нiякого прогностичного значення [109].

Роботи, зробленi з використанням резистентних до дii цисплатина лiнiях клiтин показали важливiсть онкогена fos в резистентностi до цього препарату. В резистентних лiнiях клiтин спостерiгали пiдвищений рiвень експресii гена fos. Були визначенi двi важливi функцii Fos-бiлка: транскрипцiйна активацiя синтеза ДНК та участь у клiтниннiй пролiферацii. Fos-бiлок контролюi клiтинну вiдповiдь на пошкодження ДНК цисплатином через активацiю генiв топоiзомерази РЖ, полiмерази b та металотеонеiна [2].

Повiдомляiться про те, що гiперекспресiя супресорного гена nm 23 супроводжуiться, як правило, збiльшенням чутливостi до дii цисплатина. Данi результати отримано з дослiджень in vitro на клiтинних лiнiях карциноми молочноi залози людини MDA-MB-435, лiнii карциноми яiчника OKAR-3 та лiнii меланоми К-1735-ТК, а також при дослiдженнi клiнiчного матерiалу пухлин молочноi залози. У всiх дослiджуваних системах гiперекспресiя nm 23 призвела до формування у клiтинах великоi кiлькостi мiжланцюгових зшивок ДНК та збiльшення чутливостi до цисплатина [110].

Цiкавими i данi по переносу резисткнтного до цисплатина фенотипу при трансфекцii генiв v-src. Непухлиннi епiтелiальнi клiтини людини HAG-1 пiсля трансфекцii гену v-src набували неопластичного фенотипу та резистентностi до цисплатина. У трансформованих клiтинах спостерiгали значне зменьшення формування мiжланцюгових зшивок ДНК з iх послiдовним швидким видаленням. Пiсля обробки даних клiтин iнгiбiторами src-кiназ знижувався рiвень резистентностi до цисплатина. Результати цiii роботи вказують на можливiсть участi продукту гена v-src в iндукцii резитентностi до цисплатина шляхом модуляцii деяких шляхiв репарацii ДНК [111].

Амплiфiкацiя гена сорцина (кальцiй-звязуючого бiлка з молекулярною масою 19-22кД) в деяких модельних системах асоцiювалася з резистентним фенотипом [112]. Важко зараз сказати, чи i резистентнiсть пов`язаною саме з сорцином чи разом з геном сорцина у клiтинах амплiфiкованi i iншi, бiльш важливi для розвитку резистентностi гени.

Таким чином резистентнiсть до цисплатина маi комплексний характер i пов`язана з рядом особливостей клiтин на рiвнi цитоплазматичноi мемрани, внутрiшньоклiтинних систем детоксикацii, систем репарацii та порушення функцiональноi активностi генiв p 53, bcl-2, fos, mdm 2, nm23та iнших.

Список лiтератури

1. Чехун ВФ. Роль плазматичних мембран нормальних i пухлинних клiтин в механiзмi реалiзацii цитотоксичних ефектiв координацiйних сполук платини [Автореф дис .. докт мед наук]. Киев: ИЭПОР, 1994. 40 сс.

2. Scanlon KJ, Kashani-Sabet M, Tone T, Funato T. Cisplatin resistance in human cancers. Pharmacol Ther 1991; 52:385-406.

3. Gately DP, S.B.Howell SB. Cellular accumulation of the anticancer agent cisplatin. Br J Cancer 1993; 67:1171-6.

4. Ohmori T, Morikage T. The mechanism of the difference in cellular uptake of platinum derivatives in non-small cell lung cancer cell line (PC-14) and its cisplatin-resistant subline (PC-14/CDDP). Jpn J Cancer Res 1993; 84: 83-92.

5. Scanlon KJ, Safistein RL, Thies H, Gross RB, Waxman S, Guttenplan JB. Inhibition of amino acid transport by cis-diamminedichloroplatinum (II) derivatives in L1210 murine leukemia cells. Cancer Res 1983; 43: 4211-5.

6. Andrews PA, Velury S, Mann SC, Howell SB. Cis-diamminedichloroplatinum II accumulation in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1988; 48: 68-73.

7. Richon VM, Schulte N, Eastman A. Multiple mechanisms of resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II) in murine leukemia L1210 cells. Cancer Res 1987 47: 2056-61.

8. Zaman GJR, Lakelma J, Tellingen O, Beijnen J, Dekker H, Paulusma C, Oude Elferink RPJ, Baas F, Borst P. Role of glutathione in the export of compaunds from cells by the multidrug-resistance-associated protein. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:7690-4.

9. Muller V, Meijer C, Zaman GJR. Overexpression of the gene encoding the multidrug resistance-assiciated protein results in increased ATP-dependent glutathione S-conjugate transport. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 13033-7.

10. Ishikawa T, Ali-Osman F. Glutathione-associated cis-diamminedichloroplatinum (II) metabolism and ATP-dependent efflux from leukemia cells. J Biol Chem 1993; 268: 20116-25.

11. Laurent G, Erickson LC, Sharkey NA, Kohn KW. DNA cross-linking and cytotoxicity induced by cis-diamminedichloroplatinum (II) in human normal and tumor cell lines. Cancer Res 1981; 41: 3347-51.

12. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events associated with cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatin. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 749-55.

13. Olivero OA, Chang PK, Lopez-larraza DM, Semino-Mora MC, Poirier MC. Preferential formation and decreased removal of cisplatin-DNA adducts in chinese hamster ovary cell mitochondrial DNA as compared to nuclear DNA. Mutat Res 1997, 391(1-2): 79-86.

14. Giurgiovich AJ, Diwan BA, Olivero OA, Anderson LM, Rice JM, Poirier MC. Elevated mitochondrial cisplatin-DNA adduct levels in rat tissues after transplacental cisplatin exposure. Carcinogenesis 1997, 18(1): 93-6.

15. Gorczyca W, Gong I, Ardelt B, Traganos F, Darzynkiewicz Z. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Res 1993, 53(13): 3186-92.

16. el Alaoui S, Lawry J, Griffin M. The cell cycle and induction of apoptosis in a hamster fibrosarcoma cell line treated with anticancer drugs: its importance to solid tumor chemotherapy. J Neurooncol 1997, 31(1-2): 195-207.

17. Vaisman A, Varchenko M, Said I, Chaney SG. Cell cycle changes associated with formation of Pt-DNA adducts in human ovarian carcinoma cells with different cisplatin sensitivity. Cytometry 1997, 27(1): 54-64.

18. Nishio K, Saigo N. Effect of cisplatin on cell cycle regulators. Gan To Kagaku Ryoho 1994, 21(3): 289-94.

19. Dimanche-Boitrel MT, Micheau O, Hamman A, Haugg M, Eymin B, Chauffert B, Solary E. Contribution of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIP1 to the confluence-dependent resistance of HT 29 human colon carcinoma cells. Int J Cancer 1998, 77(5): 796-802.

20. Gill JS, Mindebank AJ. Cisplatin-induced apoptosis in rat dorsal root ganglion neurons is associated with attempted entry into the cell cycle. J Clin Invest 1998, 101(12): 2842-50.

21. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM. Induction of p 21 WAF1?CIP1/SDI1 in kidney tubule cells affects the course of cisplatin-induced acute renal failure. J Clin Invest 1998, 101(4): 777-82.

22. Otto AM, Paddenberg R, Schubert S, Mannherz HG. Cell cycle arrest, micronucleus formation, and cell death in growth inhibition of MCF-7 breast cancer cells by tamoxifen and cisplatin. J Cancer Res Clin Oncol 1996, 122(10): 603-612.

23. Boersma AW, Nooter K, Oostrum RG, Stoter G. Quantification of apoptotic cells with fluorescein isothiocyanate-labeled annexin V in chinese hamster ovary cells cultures treated with cisplatin. Cytometry 1996, 24(2): 123-130.

24. Ormerod MG, O`Neill C, Robertson D, Helland LR, Harrap KR. Cis-diamminedichloroplatinum (II)-induced cell death through apoptosis in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cell lines. Cancer Chemother Pharmacol 1996, 37(5): 463-471.

25. Uslu R, Jewett A, Bonavida B. Sensitization of human ovarian tumor cells by subtoxic CDDP to anti-fas antibody mediated cytotoxicity and apoptosis. Gynecol Oncol 1996, 62(2): 282-91.

26. Fulda S, Sieverts H, Friesen C, Herr I, Debatin KM. The CD95(APO-1/Fas) system mediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells. Cancer Res 1997, 57(17): 3823-9.

27. McGahon AJ, Costa Pereira AP, Daly L, Cotter TG. Chemotherapeutic drug-induced apoptosis in human leukaemic cells is independent of the Fas(APO-1/CD95) receptor/ligand system. Br J Haematol 1998, 101(3): 539-47.

28. Antoku K, Liu Z, Johnson DE. Inhibition of caspase proteases by CrmA enhances the resistance of human leukemia cells to multiple chemotherapeutic agents. Leukemia 1997, 11(10): 1665-72.

29. Chen Z, Naito M, Mashima T, Tsuruo T. Activation of actin-cleavable interleukin 1 beta-converting enzyme (ICE) family protease CPP-32 during chemotherapeutic agent-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1996, 56(22): 5224-9.

30. Marissen WE, Lloyd RE. Eukariotic translation initiation factor 4G is targeted for proteolytic cleavage by caspase 3 during inhibition of translation in apoptotic cells. Mol Cell Biol 1998, 18(12): 7565-74.

31. Kraker AJ, Moore CW. Accumulation of cis-diamminedichloroplatinum (II) and platinum analogues by platinum-resistant murine leukemia cells in vitro. Cancer Res 1988; 48: 9-13.

32. Eichholtz-Wirth H, Hietel B. The relationship between cisplatin sensitivity and drug uptake into mammalian cells in vitro. Br J Cancer 1986; 54: 239-43.

33. Kawai K, Kamatani N, Georges E, Ling V. Identification of a membrane glycoprotein overexpression in murine lymphoma sublines resistant to cis- diamminedichloroplatinum (II). J Biol Chem 1990; 265: 13137-42.

34. Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump Is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum (II)-resistant human leukemia HL-60 Cells and downregulated by cell differentiation. J Biol Chem 1994; 269: 29085-93.

35. Goto S, Yoshido K, MoriKawa T, Urata Y, Suzuki K,. Kondo T. Augmentation of transport for cisplatin-glutathione adduct in cisplatin-resistant cancer cells. Cancer Res 1995; 55: 4297-301.

36. Veneroni S, Zaffaroni N, Daidone MG, Benini E, Villa R, Silvestrini R. Expression of P-glycoprotein and in vitro or in vivo resistance to doxorubicin and cisplatin in breast and ovarian cancers. Eur J Cancer 1994; 30A: 1002-7.

37. Jedlitschky G, Leier J, Buchholz U, Barnouin K, Kurz G, Keppler D. Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate conjugates by the MRP gene-encoded conjugate export pump. Cancer Res 1996; 56: 988-94.

38. Okuyama T, Maehara Y, Endo K, Baba H, Adachi Y, Kuwano M, Sugimachi K. Expression of glutathione S-transferase-pi and sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin. Cancer 1994; 74: 1230-6.

39. Awasthi S, Sharma R, Singhal SS, Herzog NK, Chaubey M, Awasthi YC. Modulation of cisplatin cytotoxicity by sulphasalazine. Br J Cancer 1994; 70: 190-4.

40. Bongers V, Snow GB, Braakhuis BJM. The role of glutathione S-transferases in head and neck squamous cell carcinogenesis. Eur J Cancer 1995; 31B: 349-54.

41 Minagawa Y, Kigawa J, Ishihara H, Itamochi H, Terakawa N. Synergistic enhancement of cisplatin cytotoxicity by SN-38, an active metabolite of CPT-11, for cisplatin-resistant HeLa cells. Jpn J Cancer Res 1994; 85: 966-71.

42. Boscia RE, Korbut T, Holden SA, Ara G, Teicher BA. Interaction of topoisomerase I inhibitors with radiation in cis-Diamminedichloroplatinum (II)-sensitive and -resistant cells in vitro and in the FSAIIC fibrosarcoma in vivo. Int J Cancer 1993; 53: 118-23.

43. Kikuchi Y, Hirata J, Yamamoto K, Ishi K, Kita T, Kudoh K, Tode T, Nagata I, Taniguchi K, Kuwano M. Altered expression of -glutamylcysteine synthetase, metallothionein and topoisomerase I or II during acquisition of drug resistance to cisplatin in human ovarian cancer cells. Jpn J Cancer Res 1997; 88: 213-7.

44. Hirata J, Kikuchi Y, Kita T, Imaizumi EE, Tode T, Ishii K, Kudoh K, Nagata I. Modulation of sensitivity of human ovarian cancer cells to cis-diamminedichloroplatinum (II) by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and D,L-Buthionine-S,R-Sulphoximine. Int J Cancer 1993; 55: 521-7.

45.Sugimoto C, Matsukawa S, Fujieda S, Noda I, Tanaka N, Tsuzuki H, Saito H. Involvement of intracellular glutathione in in

Вместе с этим смотрят:

G-белки и их функция

Австралопитеки - обезьянолюди или человекообезьяны?

Адаптация микроорганизмов в экстремальных условиях космоса

Адвентивна флора Чернiгiвськоi областi: iсторiя формування та сучасний стан

Адсорбция ионных и неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ)