Ферменты биологической мембраны

Многие клеточные процессы катализируются мембраносвязанными ферментами. При этом мембрана может выполнять целый ряд функций. Связав фермент с определённой мембраной или участком на мембране, можно локализовать каталитический центр в определённой части клетки. Существует множество примеров, когда несколько действующих последовательно ферментов организованы подобным образом в суперкомплекс, что позволяет увеличить суммарную скорость реакции. Многие мембранные ферменты представляют собой белки, пронизывающие мембрану насквозь, и участвуют в трансмембранном транспорте растворённых веществ или в передаче информации с одной стороны бислоя на другую в форме трансмембранного аллостерического сигнала. Другие ферменты являются периферическими мембранными белками и в некоторых случаях способны связываться с мембраной только в ответ на определённый физиологический сигнал.

Цель работы: изучение ферментов биологической мембраны.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Ознакомиться с литературой;

2. Изучить виды ферментов биологической мембраны, их биологическое значение.

3. Ознакомиться с проблемой изучения каталитической активности мембранных ферментов.

1. Классификация ферментов биологической мембраны

Биомембрана тАУ это не просто некая пассивная структура, ограничивающая водные компартменты. Уже краткое знакомство с типами ферментов, связанных с мембранами, показывает, насколько разнообразны ассоциированные с мембранами каталитические активности.

1. Трансмембранные ферменты, катализирующие сопряжённые реакции на противоположных сторонах мембраны. Характерными примерами могут служить окислительно-восстановительные ферменты, например фотосинтетические реакционные центры растений и бактерий или цитохром с-оксидаза митохондрий. Расположенные на противоположных сторонах мембраны активные центры этих ферментов сопряжены друг с другом с помощью потока электронов, генерирующего трансмембранный электрический потенциал. К этому классу ферментов могут быть отнесены также многие рецепторы. Связывание лиганда (например, гормона) с доменом, локализованным с наружной стороны клеточной мембраны, приводит к изменениям в цитоплазматическом домене фермента, которые, в свою очередь, инициируют клеточный ответ. В этом случае через мембрану переносится информация, а не заряды или какие-либо растворенные молекулы. Показано, что некоторые рецепторы являются тирозиновыми протеинкиназами (см. разд. 9.7) и, следовательно, представляют собой мембранные ферменты, обладающие каталитической активностью.

2. Трансмембранные ферменты, участвующие в транспорте веществ. Многие мембранные белки участвуют в транспорте молекул через бислой. Активный транспорт может быть сопряжен с гидролизом ATP, как в случае Ca-ATPазы саркоплазматического ретикулума. Движущей силой активного транспорта могут быть также ионные градиенты.

3. Белки, являющиеся компонентами электронтранспортных цепей. Наиболее типичные ферменты этого класса тАФ компоненты дыхательной цепи митохондрий, заканчивающейся цитохром с оксидазой; ферменты системы электронного транспорта микросом, включающие цитохром Р450 и цитохром b₅; элементы фотосинтетической электронтранспортной цепи в тилакоидах. Локализация компонентов электронтранспортных цепей в мембране приводит к увеличению их локальной концентрации, что позволяет значительно ускорить перенос электронов между молекулами.

4. Ферменты, способные использовать мембраносвязанные субстраты. В этот класс могут входить ферменты, участвующие в метаболизме компонентов мембраны: фосфолипидов, гликолипидов, олиизопреноидных соединений и стероидов, а также ферменты, частвующие в процессинге мембранных и секреторных белков. В большинстве случаев эти ферменты являются интегральными мембранными белками, но иногда (примером могут служить фосфолипазы) представляют собой растворимые белки, лишь временно связанные с мембраной. Примерами белков этого типа являются лидерная пептидаза из Е.соli и фосфолипаза С, связанные с мембраной посредством гликозилфосфатидилинозитольного якоря.

5. Ферменты, использующие водорастворимые субстраты. Многие мембраносвязанные ферменты используют растворимые субстраты. В некоторых случаях фермент локализуется в такой области мембраны, где велика концентрация субстрата. Например, ацетилхолинэстераза, катализирующая гидролиз ацетилхолина, по-видимому, фиксируется в постсинаптической мембране с помощью ковалентной сшивки с фосфатидилинозитольным гликолипидом. Целый ряд ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков, прикрепляется к мембранам микроворсинок кишечника с помощью гидрофобных доменов, расположенных в N-концевой части полипептидов.

6. Ферменты, образующие мембраносвязанный комплекс для облегчения канализации субстрата. Мембраны могут служить своеобразным организующим каркасом, с которым связываются периферические ферменты с образованием мультиферментного комплекса. Имеются косвенные данные о том, что участвующие в реакциях цикла Кребса ферменты матрикса митохондрий связываются с мембраной таким образом, что продукт одного фермента становится субстратом другого, не выходя за пределы мультиферментного комплекса.

7. Ферменты, которые совершают челночные перемещения между цитозолем и мембраной и активность которых модулируется связыванием с мембраной. Эта группа мембранных ферментов обнаружена недавно. Они способны связываться либо прямо с поверхностью фосфолипидного бислоя, либо со специфическими белковыми рецепторами. Чаще всего эти ферменты активируются при связывании с мембраной, но иногда наблюдается и их инактивация. Типичными примерами ферментов, активирующихся при связывании, являются пируватоксидаза из Е. соli, протеинкиназа С и некоторые ферменты, участвующие в каскаде свертывания крови.

2. Биологическое значение мембранной организации ферментов

Изучение роли мембранной организации белков непосредственно в живом организме затруднено из-за сложной организации живой материи и одновременного протекания множества взаимосвязанных процессов. Однако, возможность проведения мутации генов, обеспечивающей избирательные изменения в структуре экспрессируемых белков, например, экспрессию только растворимых форм белков, позволяет в некоторых случаях показать важность функционирования именно мембраносвязанных белков. Рассмотрим это на примере Kit-лиганда тАФ одного из мембраносвязанных факторов роста млекопитающих. Для мутантной формы этого интегрального гликопротеина I типа, не содержащей трансмембранного и цитоплазматического доменов, была продемонстрирована нормальная экспрессия in vivo и биологическая активность при исследовании слияния клеток, аналогичная активности секретируемой формы нативного белка. Однако у мыши, имеющей ген такого белка, проявлялись все симптомы животного, вообще лишенного гена Кit-лиганда тАФ макроцитарная анемия, бесплодие, белый окрас.

Недавние исследования также убедительно подтверждают физиологическую значимость мембранной формы АПФ. Мышь, у которой ген нативного АПФ был заменен на ген, кодирующий фермент без якоря таким образом, что весь секретируемый фермент был активен, однако не встраивался в мембрану, имела все симптомы ВлнокаутногоВ» животного, полностью лишенного гена АПФ: низкое давление, неконтролируемое мочеиспускание, бесплодие, различные сосудистые дисфункции, нарушения структуры и функции почек.

Отметим, что важность связывания с биомембраной выявлена не только для интегральных белков, но и продемонстрирована в ряде случаев для периферических белков, например, пируватоксидазы тАФ периферического фермента, катализирующего окисление пирувата до уксусной кислоты и восстановление убихинона. Указанный фермент циркулирует в организме и связывается с плазматической мембраной лишь в присутствии субстрата и кофактора; при этом в молекуле белка формируется С-концевой липидсвязывающий домен. Показано, что мутантная форма пируватоксидазы, лишенная последних 24 аминокислотных остатков, полностью неактивна in vivo из-за неспособности связываться с мембраной.

Таким образом, биологическая роль различных мембранных ферментов может в значительной степени определяться их способностью к связыванию с мембраной. Во-первых, связывание с биомембраной обеспечивает локализацию (концентрирование) ферментов в определенной части клетки и/или в той области мембраны, где концентрируется субстрат. Например, ацетилхолинэстераза фиксируется в постсинаптической мембране, где велика концентрация ацетилхолина. Во-вторых, адсорбция ферментов на мембране создает возможность для сопряжения процессов катализа и трансмембранного переноса. Так, при функционировании мембраносвязанных ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков, вблизи клеточной мембраны создается локально высокая концентрация растворимых молекул продукта, что способствует их эффективному поглощению клеткой. В-третьих, для многих ферментов при связывании с мембраной обеспечивается доступность водонерастворимых субстратов. Это могут быть интегральные ферменты, участвующие в процессинге мембранных белков, а также периферические ферменты: фосфолипазы, протеинкиназа С, пируватоксидаза и др. Наконец, при связывании формируется оптимальное микроокружение, обеспечивающее нативную конформацию и каталитическую активность мембранных ферментов.

3. Изучение активности мембранных ферментов

Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределённым и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент ВлзастреваетВ» в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную Влрабочую конформациюВ».

После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Изучение очищенных и реконструированных ферментов даёт большие преимущества. В частности, в такой системе не протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей.

Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу, прежде всего, необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100.

Методы реконструкции можно разделить на две группы.

1. Процедуры, при которых белок предварительно очищают от детергента, а затем проводят реконструкцию.

2. Процедуры, в которых белки и фосфолипиды смешивают в присутствии детергента, а затем удаляют детергент до образования протеолипосом. Выбранный фосфолипид должен быть способен к формированию стабильных бислоев.

Реконструкция без избытка детергента

1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами.

Этот способ используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома b5 и в-гидроксибутиратдегидрогеназы.

2. Реконструкция с участием амфифильных катализаторов.

Добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочесные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нём не используют какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространён.

3. Замораживание тАУ оттаивание/обработка ультразвуком.

Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание тАУ оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более однородные по размерам.

Реконструкция с использованием детергентов

В настоящее время для реконструкции используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем, чтобы их можно было легко удалить диализом или гель-фильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na⁺/K⁺-ATPазы.

С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гель-фильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента (например, при реконструкции глицеро-3-фосфатацилтрансферазы и фосфатидилинозитолсинтазы)

Ещё более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.

Обычно используемый для отчистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем тАУ потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.

И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращённой фазы.

4. Регуляция активности мембраносвязанных ферментов

Мембранные ферменты отличаются от растворимых ферментов одним важным свойством: все они прочно связаны с липидным бислоем соответствующих мембран. Поэтому помимо субстратов, активаторов или ингибиторов их регуляторами являются сами мембранные липиды. Липиды при этом могут выполнять две функции: 1) создавать необходимую среду; 2) действовать как аллостерический регулятор, модулирующий активность фермента. В первом случае липиды не только предотвращают денатурацию ферментов друг с другом и с прочими мембраносвязанными компонентами, в частности с липофильными субстратами. В качестве аллостерических эффекторов липиды обычно активируют фермент преимущественно путём стабилизации его в определённой стабилизации. В идеальной экспериментальной системе аллостерическим эффектором должен быть специфический липид, а необходимое для работы окружение фермента должно создаваться всей основной массой липидов в бислое. К сожалению, пока обнаружен только один пример абсолютной специфичности фермента к определённому липиду. β-Гидроксибутиратдегидрогеназе для проявления каталитической активности необходим именно фосфатидилхолин, а в большинстве случаев ферменты достаточно эффективно активируются различными липидами. На ферментативную активность может влиять также физическое состояние бислоя, в частности поверхностная плотность заряда и вязкость. Изменение физического состояния бислоя может влиять на взаимодействие с ферментом любых липидов, в том числе и тех, которые функционируют как аллостерические эффекторы.

Для исследования влияния липидов на мембранные ферменты применяется метод смешанных мицелл. Фермент растворяют в детергенте, не активирующем его, и к смеси добавляют липиды. Многие мембранные ферменты сохраняют определённую активность и в детергенте, причём такая активность сильно зависит не только от природы фермента, но и от выбранного детергента, а также, возможно, от наличия эндогенных липидов в препарате очищенного фермента. Для метода смешанных мицелл желательно полностью освободить фермент от липида. Методы полного обезжиривания обычно основаны на пропускании препарата фермента через среду с большим избытком детергента. Для этого используют гель-фильтрацию, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или связывание фермента с каким-либо твёрдым носителем (например, ДЭАЭ-сефарозой) с последующим промыванием избытком детергента.

Метод смешанных мицелл имеет ещё и то преимущество, что липофильный субстрат можно добавить в мицеллах того же детергента, хотя в этом случае могут возникнуть трудности, связанные с пространственным разделением фермента и субстрата. К сожалению, физическое состояние комплекса фермент-детергент-фосфолипид определить практически невозможно, и это серьёзный недостаток описываемого подхода.

Результаты исследования многих систем позволяют сделать несколько общих выводов.

1. Для активации фермента очень редко бывает необходим липид с какой-то строго определённой структурой. Одни липиды активируют данный фермент с большей эффективностью, чем другие, однако такое предпочтение может зависеть от условий измерения. Может оказаться, что липид, с высокой эффективностью активирующий фермент, вообще не присутствует в мембране, из которой этот фермент выделен.

2. Измеряемая в системе со смешанными мицеллами зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации липида обычно свидетельствует о высокой кооперативности процесса. Такое поведение можно объяснить, в частности, тем, что липиды связываются некооперативно с несколькими эквивалентными центрами на ферменте, но активными являются только те молекулы фермента, у которых занята большая часть липидсвязывающих центров.

3. Сама по себе бислойная структура не является необходимой для активации ферментов, поскольку многие ферменты проявляют активность в присутствии детергента или в составе липидно-детергентных мицелл.

4. Важным параметром, определяющим активность большинства мембранных ферментов, безусловно, является физическое состояние бислоя. При переходе липидов в фазу геля многие ферменты становятся неактивными либо их активность резко уменьшается. Выявить связь ферментативной активности с вязкостью мембраны, исходя из температурной зависимости, весьма непросто, поскольку температура влияет одновременно на очень многие параметры. Следует иметь в виду, что вязкость мембраны в значительной степени коррелирует с плотностью упаковки молекул липида в бислое, индуцируемые температурой изменения вязкости можно объяснить в основном изменениями в плотности упаковки. Липиды могут сильно влиять не только на максимальную скорость, но и на связывание фермента с субстратами и кофакторами.

5. Вообще говоря, при исследовании взаимодействия с определенным ферментом большого числа разных липидов корреляции между активностью фермента и каким-либо одним параметром (например, вязкостью) не наблюдается. Пока липид находится в жидкокристаллическом состоянии, для ферментативной активности часто более важна структура полярной головки липида, чем вязкость бислоя. Другими словами, важна химическая структура индивидуальных липидов.

Заключение

Мембранные ферменты в составе бислоя приобретают большую стабильность и способность к осуществлению реакций, которые в гидрофильном окружении протекали бы с весьма малой скоростью. Липидное окружение предоставляет таким белкам ВлпривилегированныеВ» условия функционирования, но и накладывают ограничения на поведение белковых ассоциатов: последнее сильно зависит от плотности упаковки мембран. Интерпретировать данные по влиянию липидов на активность изолированных мембранных ферментов часто очень непросто. Изучение очищенных мембранных белков ставит перед исследователем огромное множество совершенно особых проблем, не встречающихся при работе с растворимыми ферментами.

Литература

1. Р. Геннис. Биомембраны.тАУ Москва: ВлМирВ», 1997. тАУ 624с.

2. С.В. Гринштейн, О.А. Кост. Структурно-функциональные особенности мембранных белков. тАУ Москва: МГУ, 104с.

3. С.Е. Северин, Г.А. Соловьёва. Практикум по биохимии. тАУ Москва: Изд-во МГУ, 1989. тАУ 509с.

4. Б.Ф. Коровкин, Т.Т. Берёзов. Биологическая химия. тАУ Москва: ВлМедицинаВ», 1998. тАУ 704с.

Вместе с этим смотрят:

G-белки и их функция

Австралопитеки - обезьянолюди или человекообезьяны?

Адаптация микроорганизмов в экстремальных условиях космоса

Адвентивна флора Чернiгiвськоi областi: iсторiя формування та сучасний стан

Адсорбция ионных и неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ)