<< Пред. стр. 23 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу
- обнаружение и количественная оценка разделенных веществ.
Фронтальный электрофорез
Электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде в
кювете, которая представляет собой разборный U-образный канал. В
кювете создают четкую границу между исследуемой смесью веществ и
буферным раствором. В процессе электрофореза первоначальная
граница постепенно расходится на ряд границ по числу компонентов
смеси.
Метод является единственным способом прямого определения
абсолютной электрофоретической подвижности. Его применяют для
веществ с высокой молекулярной массой, которые обладают слабой
диффузией.
Зональный электрофорез
Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль
которой состоит в стабилизации электрофоретических зон. В
зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез
имеет много вариантов.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОЙ ЖИДКОСТИ
Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды
используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина,
гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой
жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют
внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки
закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки
присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез.
Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют
жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и рН.
Градиент рН достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой
готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или
экспериментально подобранных смесей, которые при приложении
электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих
изоэлектрических точек (рI). В результате в колонке создается
градиент рН от 1 до 11. При электрофоретическом разделении,
например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до
зоны, соответствующей его рI.
Метод позволяет разделять вещества, различие в рI которых
составляет до 0,02, а также определять их рI.
В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет
обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях
непосредственно после электрофореза.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КРУПНОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ
В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную
бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар -
агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок.
Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал,
который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с
двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором.
Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и
вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока.
После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли
из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое
вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной
массой выше 30 000, так как вещества с меньшей молекулярной массой
проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен.
Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспендированным в
буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных
веществ (что имеет место для большинства биологических материалов)
наносят в колонку сверху, а положительно заряженных - снизу. Сбор
фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного
элюирования буферным раствором.
Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной
установки представляет собой полую стенку, которую заполняют
носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном
направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора
сверху вниз. Наверх кюветы в одно и то же место непрерывно подают
тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием
электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере
спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна
кюветы фракции собирают в серию пробирок.
Вариант этого метода на бумаге известен под названием
вертикального электрофореза.
Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию,
наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной
бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг
от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в
кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью
к ее концам подключают электрический ток. По окончании
электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают
результаты в соответствии с указаниями в статьях.
Для электрофореза пригодны только лучшие сорта
хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96%
альфа - целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают
хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо
бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА МЕЛКОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ
На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не
только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в
зависимости от молекулярной массы и формы молекул.
Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной
1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала,
полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси
алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя
или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор
исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь
отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно
проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на
бумаге.
Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из
гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной
5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что
в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм).
В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором
исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный
электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках.
Преимущество горизонтального варианта - простота исполнения,
вертикального - большая разрешающая сила.
Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель
(ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации
акриламида и сшивающего агента, чаще всего
N, N1-метиленбисакриламида. Благодаря образованию поперечных
связей между растущими соседними полиакриламидными цепями,
возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой
гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного
полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически
стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры,
нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем
практически отстутствуют адсорбция и электроосмос.
ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку
и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2
до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость.
Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого
вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней
молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ:
М. м. с, %
3
< 10 х 10 > 30,0
3
10-30 х 10 15,0-30,0
3
30-100 х 10 7,5-15,0
3
> 100 х 10 < 7,5
Электрофорез выполняют в установках вертикального или
горизонтального типа. В ходе электрофореза необходимо следить за
тем, чтобы кювета не перегревалась во избежание возникновения
конвекционных токов.
Диск - электрофорез представляет собой разновидность
электрофореза в ПАГ. Метод имеет высокую разрешающую способность
благодаря использованию двух физических явлений:
1) эффекта концентрирования анализируемой смеси в узкой
стартовой зоне (бесконечность 10"ми"), который обусловлен
автоматическим выравниванием скоростей движения ионов на границе
Кольрауша;
2) эффекта молекулярного сита, т.е. разделения вещества по
величине молекулярной массы и по форме молекул.
Диск - электрофорез обычно проводят в узких стеклянных
трубках, содержащих два разнопористых геля. В ходе электрофореза в
верхнем относительно более крупнопористом геле происходит
концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом - ее разделение.
Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах,
которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах.
Схема проведения опыта: стеклянные трубки последовательно
заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется
мелкопористый, а затем - крупнопористый гель, после чего трубки
соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным
раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы
трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец.
После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и
определяют исследуемые вещества.
Изотахофорез представляет собой также разновидность
электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы,
в которой ведущий ион имеет высокую подвижность, а замыкающий -
низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода.
КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза
с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в
тонком слое геля. После электрофореза в геле в направлении
движения белков делают боковые углубления, которые заполняют
соответствующей антисывороткой. Затем пластинки на 1-2 сут
помещают во влажные камеры, где в результате диффузии антигены
взаимодействуют с антителами и образуют изогнутые зоны
преципитации. Метод позволяет выявлять индивидуальные белки.
Метод пептидных карт представляет собой сочетание бумажной и
тонкослойной хроматографии с высоковольтным электрофорезом. В
качестве носителей используют силикагель или порошок целлюлозы.
Вначале проводят хроматографию, для чего пробу наносят в точку
вблизи одной стороны бумаги или пластинки, а затем под углом 90
град. проводят высоковольтный электрофорез. Метод применяют для
разделения смеси низкомолекулярных соединений.
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
В зависимости от варианта метода результаты электрофореза
оцениваются разными способами:
- документирование (фотографирование или зарисовка);
- определение величины абсолютной или относительной
электрофоретической подвижности;
- денситометрия;
- определение характерных химических, физико-химических или
биологических показателей фракций.
Для окраски электрофореграмм наиболее часто применяют
следующие красители: для белков - амидошварц 10 В, кумаси,
бромфеноловый синий, азокармин В; для липидов и липопротеидов -
жировой краситель 0, судан черный; для моносахаридов - водородно -
анилино - фталатный реактив; для высших жирных кислот - краситель,
состоящий из метилового красного и бромтимолового синего.
МЕТОД ФАЗОВОЙ РАСТВОРИМОСТИ
Метод фазовой растворимости - это количественное определение
чистоты вещества путем точных измерений величины растворимости.
Практическое выполнение анализа данным методом заключается в
определении величины растворимости исследуемого вещества в
растворителе в условиях равновесия при постоянных температуре и
давлении. Для этой цели прибавляют возрастающие количества образца
к постоянному количеству растворителя, помещенному в одинаковые
емкости. Системы, состоящие из вещества и растворителя, приводят в
состояние равновесия длительным встряхиванием при постоянной
температуре. Затем определяют содержание растворенного вещества в
каждой системе.
Строят диаграмму (рис. 12) <*>, откладывая по оси ординат
массу растворенного вещества на единицу массы растворителя (состав
раствора) и по оси абсцисс - массу прибавленного вещества на
единицу массы растворителя (состав системы).
--------------------------------
<*> Рис. 12. Типичная диаграмма фазовой растворимости.
АВ - состав системы, соответствующей ненасыщенным истинным
растворам; ВС - состав системы, соответствующей насыщенным
растворам; СД - линия растворимости; ДЕ - состав системы,
насыщенной всеми компонентами испытуемого вещества. (Рисунок не
приводится).
При данной температуре в определенном количестве растворителя
растворяется определенное количество чистого вещества. Полученный
раствор насыщен определенным веществом, но этот же раствор
остается ненасыщенным в отношении других веществ, даже если эти
вещества могут быть близки по химическому строению и физическим
свойствам к данному исследуемому веществу. Равные величины
растворимости, полученные в каждой системе, указывают на то, что
материал чист или свободен от посторонних веществ. Исключением
является случай, когда процентный состав исследуемого вещества
равен отношению величин растворимости соответствующих компонентов.
Различие в значениях растворимости для каждой системы указывают на
наличие примеси или примесей.
Метод фазовой растворимости применим ко всем видам соединений,
которые образуют устойчивые истинные растворы.
Растворители. При выборе подходящего растворителя для метода
фазовой растворимости пользуются следующими критериями.
1. Растворитель должен иметь такую летучесть, чтобы его можно
было выпарить в условиях вакуума - 1 кгс/кв. см, но не настолько
летучим, чтобы в процессе анализа происходили его потери. Обычно
подходят растворители с точкой кипения от + 60 до + 150 град. С.
2. Растворитель не должен неблагоприятно влиять на образец.
Нельзя использовать растворители, которые вызывают разложение
образца или реагируют с ним. Следует избегать растворителей,
образующих сольваты или соли, так как при высушивании подобных
соединений возможно растрескивание кристаллов и как следствие
этого - изменение массы высушенных остатков.
3. Степень чистоты и состав растворителя должны быть известны.
Допускаются тщательно приготовленные смешанные растворители.
Следовые количества примесей в растворителях могут существенно
влиять на растворимость.
4. Оптимальной растворимостью испытуемого вещества в избранном
растворителе является растворимость в пределах от 5 до 25 мг на 1
г растворителя.
Приборы. Используют термостат, способный поддерживать заданную
температуру в пределах +/-0,1 град. С. Для удобства работы обычно
выбирают температуру от +25 до +30 град. С. Термостат оборудуют
подходящим вибратором, обеспечивающим 100-120 колебаний в секунду
и имеющим приспособление с зажимами для ампул. Вместо этого
термостат может быть снабжен горизонтальным устройством, способным
вращаться со скоростью приблизительно 25 об/мин и имеющим зажимы
для ампул.
Емкости, используемые в анализе. Используют любые ампулы
вместимостью 15 мл. Можно использовать и другие емкости при
условии, что они герметичны и подходят во всех других отношениях
(рис. 13) <*>. Выпаривание растворителя проводят в колбочках,
пригодных для лиофилизации, или в бюксах подходящей емкости.
--------------------------------
<*> Рис. 13. Ампула (слева) и колбочки (справа), применяемые
при анализе методом фазовой растворимости. (Рисунок не
приводится).
Весы. Используют весы и метод взвешивания, обеспечивающие
точность взвешивания в пределах +/- 10 мкг.
Методика. Описанная ниже методика является общепринятой.
Однако в некоторых случаях можно предпочесть и другие условия
(объем растворителя и т. д.).
Состав системы. Точно взвешивают не менее 7 помеченных,
тщательно вымытых ампул и в каждой из них точно взвешивают
постоянно увеличиваемые количества исследуемого вещества. Массу
вещества подбирают таким образом, чтобы первая ампула содержала
немного меньше вещества, чем будет растворяться в объеме
<< Пред. стр. 23 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу