<< Пред. стр. 61 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу
кислоты и доводят объем раствора водой до метки.
5. Коэффициент пересчета тиамина хлорида на тиамина
бромид-1,29.
4. Определение содержания рибофлавина (витамина В2)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанных в соответствующих частных статьях, взбалтывают в горячей
воде при подогревании на водяной бане, количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 500 мл, охлаждают, доводят объем
раствора водой до метки и фильтруют; первые 10 мл отбрасывают. Из
полученного раствора готовят раствор второго разведения с таким
расчетом, чтобы содержание в нем рибофлавина было около 0,0004 мг
в 1 мл. В кюветы флуориметра помещают: в одну - 10 мл испытуемого
раствора, в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца
рибофлавина и измеряют флюоресценцию при длине волны около 440 нм.
Параллельно в другие кюветы помещают: в одну - 10 мл испытуемого
раствора и в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца
рибофлавина, в каждую прибавляют по 0,1 г натрия гидрокарбоната и
натрия гидросульфита, перемешивают и измеряют флюоресценцию
растворов.
Установку проводят по раствору рабочего стандартного образца
рибофлавина.
Содержание C17H2ON4O6 (рибофлавина) в одном драже или одной
таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
(А - А1) х 0,0004 х 500 х V3 х б
Х = -------------------------------- =
(В - В1) х а х V2 х 1000
(А - A1) х V3 х б
= --------------------------
(В - В1) х а х V2 х 5000
где А - показание флуориметра испытуемого раствора; А1 - то же
после гашения флюоресценции; В - показание флуориметра раствора
рабочего стандартного образца рибофлавина; В1 - то же после
гашения флюоресценции; 500; V2 и V3 - разведения в миллилитрах;
0,0004 - содержание рибофлавина в 1 мл раствора рабочего
стандартного образца в миллиграммах; а - навеска препарата в
граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя
масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 - пересчет в
граммы.
Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного
образца рибофлавина: 0,0400 г рибофлавина, предварительно
высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч,
растворяют в горячей воде в мерной колбе вместимостью 1 л при
подогревании на водяной бане, после охлаждения доводят объем
раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в
течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой
пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки; 1 мл раствора
рабочего стандартного образца содержит 0,0001 мг рибофлавина.
Раствор годен в день приготовления.
5. Определение содержания
пиридоксина гидрохлорида (витамина B6)
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанных в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем
раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл
отбрасывают. Из полученного раствора готовят раствор второго
разведения с таким расчетом, чтобы содержание в нем пиридоксина
гидрохлорида было около 0,01 мг в 1 мл; 5 мл полученного раствора
переносят в делительную воронку вместимостью 50 мл, прибавляют 10
мл фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л), 1 мл 0,1% раствора
диэтил-п-фенилендиамина сульфата, перемешивают, прибавляют 10 мл
этилацетата, 2 мл 1% раствора калия феррицианида и немедленно
тщательно перемешивают. Дают слоям разделиться, нижний водный слой
сливают в колбу и оставляют для повторного извлечения, верхний
этилацетатный слой фильтруют через сухой бумажный фильтр, на
который помещено около 8 г безводного натрия сульфата, в мерную
колбу вместимостью 25 мл. Нижний водный слой повторно извлекают 10
мл этилацетата, фильтруют, фильтр промывают этилацетатом,
присоединяют его к первому извлечению в мерной колбе и доводят
объем раствора этилацетатом до метки. Измеряют оптическую
плотность полученного раствора синего цвета на спектрофотометре
или фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нм в кюветах с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют
этилацетат.
Параллельно проводят опыт с раствором рабочего стандартного
образца пиридоксина гидрохлорида. Для этого 5 мл раствора рабочего
стандартного образца пиридоксина гидрохлорида помещают в
делительную воронку и далее поступают так, как описано выше.
Содержание C8H11NO3 х HCl (пиридоксина гидрохлорида) в одном
драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
D1 х 0,01 х 100 х V3 х б D1 х V3 х б
Х = -------------------------- = --------------------,
D0 х а х V2 х 1000 D0 х а х V2 х 1000
где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 -
оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца
пиридоксина гидрохлорида; 0,01 - содержание пиридоксина
гидрохлорида в 1 мл раствора рабочего стандартного образца в
миллиграммах; 100, V2 и V3 - разведения в миллилитрах; а - навеска
препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б
- средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 -
пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного
образца пиридоксина гидрохлорида: 0,0500 г пиридоксина
гидрохлорида растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 250 мл
и доводят объем раствора водой до метки (основной раствор).
Раствор годен в течение месяца при хранении в склянке оранжевого
стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.
5 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,01 мг
пиридоксина гидрохлорида.
Раствор годен в день приготовления.
2. Приготовление фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л) рН
6,9 - 7,1:
1) 71,64 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HPO х 12Н2О)
растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем
раствора водой до метки;
2) 27,22 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4) растворяют в
воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора
водой до метки;
3) 150 мл раствора натрия фосфата двузамещенного смешивают со
100 мл раствора калия фосфата однозамещенного.
рН полученного раствора 6,9-7,1 (потенциометрически).
Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от
5 до 10 град. С.
3. Приготовление раствора сульфата диэтил - п -
фенилендиамина: 0,1 г сульфата диэтил - п - фенилендиамина (ч. д.
а. или ч.) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл,
доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
6. Определение цианокобаламина (витамина В12)
Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим
методом с Escherichia coli 113-3 в качестве тест - микроорганизма.
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или
количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,
указанное в соответствующих частных статьях, количественно
переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и доводят
объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют. Из
полученного раствора делают разведение 1% раствором натрия цитрата
с таким расчетом, чтобы концентрация раствора для анализа была
близкой к контрольной концентрации раствора Государственного
стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл.
В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3
чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с
ровным и плоским дном, установленные на горизонтальном столе,
отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной
и охлажденной до температуры 48-50 град. С основной среды,
засеянной суспензией Е. coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл
суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды на
каждой чашке стерильным бором делают по трафарету под углом 60
град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм.
В три лунки (через одну) 6 чашек, используемых для построения
стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого
препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного
образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через
одну) каждых 3 чашек вносят по 0,1 мл одной из концентрации
остальных растворов Государственного стандартного образца, а также
раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при
37 град. С от 16 до 18 ч. После этого измеряют диаметры зон
стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой концентраций
растворов Государственного стандартного образца.
После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают
среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9
зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной
концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.
По разности между средней величиной зоны контрольной
концентрации раствора (0,05 мкг/мл), выведенной из всех чашек, и
средней величиной зоны контрольной концентрации раствора
Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с
каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны
данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней
величине зоны данной концентрации, если она положительная, и
вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают
поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.
Содержание C63H88CoN14O14P (цианокобаламина) в одном драже или
одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
С х б х К
Х = -------------,
а х 1 000 000
где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора,
найденное по стандартной кривой, в микрограммах; К - коэффициент
разведения; а - навеска препарата в граммах или количество
таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в
граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного
стандартного образца цианокобаламина: 0,0250 г Государственного
стандартного образца цианокобаламина в пересчете на 100% вещество
растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и
доводят объем раствора тем же спиртом до метки.
1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина
(основной раствор).
Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6
град. С в банке оранжевого стекла с притертой пробкой. 1 мл
основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и
доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор
годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 12 до 15
град. С.
1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из
рабочего раствора Государственного стандартного образца в день
определения готовят растворы, содержащие 0,025; 0,05 и 0,075 мкг
цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл
рабочего раствора Государственного стандартного образца помещают в
мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в
колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.
Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают
за раствор Государственного стандартного образца контрольной
концентрации.
2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям
величин зон приготовленных концентраций и средней величине зоны
контрольной концентрации из всех чашек строят стандартную кривую,
откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а
на оси ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста.
По полученным точкам вычерчивают кривую.
Применяемые для построения кривой концентрации не должны
отличаться от контрольной концентрации более чем на -40 или +50%.
3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную
культуру выращивают на скошенной агаровой среде и хранят в
холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на свежую
среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С.
Состав среды для хранения культуры:
казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г
железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г
магния сульфата (х. ч.) 0,02 г
L-аспарагина (ч.) 0,02 г
глицерина (ч.) 0,2 г
агара микробиологического 1,5 г
цианокобаламина 10 мкг
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Ингредиенты растворяют последовательно в воде.
Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2
капель раствора хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом
подогревании и прибавляют к раствору солей; устанавливают рН
полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем
среды водой до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара
микробиологического. Смесь подогревают на водяной бане до полного
растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За
сутки до проведения анализа тест - культуру пересевают на
скошенный пептонно - солевой агар следующего состава:
пептона ферментативного сухого 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г
агара микробиологического 1,8 г
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным
паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20
мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении. На скошенный агар
делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16
до 18 ч при 37 град. С и используют для приготовления посевного
материала.
4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г
казеина размолотого смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл
20% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь нагревают с
обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения
казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на
электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при
пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому
остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до
получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды,
растворяют оставшуюся массу приблизительно в 100 мл воды,
устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и
объем раствора доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г
угля активированного осветляющего, встряхивают в течение 1 ч,
затем фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем
повторяют еще раз и получают бесцветный или светло - желтый
раствор, который разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют
насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати
(0,1 МПа) 20 мин.
5. Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты: 425
мл концентрированной хлористоводородной кислоты (d 1,19)
разбавляют водой до 1 л.
6. Приготовление посевного материала: делают смыв суточной
тест - культуры со скошенного пептонно - солевого агара раствором
натрия хлорида изотоническим 0,9%. Плотность микробной взвеси
должна быть от 1 до 2 млрд микробных клеток в 1 мл.
7. Приготовление основной питательной среды.
Состав среды:
аммония хлорида (х. ч.) 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 3 г
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,4 г
натрия цитрата трехзамещенного (х. ч.) 3 г
сахара молочного 3 г
агара микробиологического 15 г
воды дистиллированной до 1 л
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным
водяным паром в автоклаве при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Хранят в
прохладном месте не более 2 мес. Перед розливом в чашки Петри в
расплавленную среду прибавляют по 5 мл стерильного 40% раствора
глюкозы на каждые 200 мл среды.
<< Пред. стр. 61 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу