<< Пред. стр. 85 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу
глюкозы 5,0 >>
цистина (цистеина) 0,75 >>
тиогликолевой кислоты или 0,3 мл
тиогликолята натрия 0,5 г
раствора резазурина натрия 1:1000
(свежеприготовленного) <*> 1,0 мл
агара 0,75 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,0 +/- 0,2
--------------------------------
<*> Допускается приготовление среды без резазурина натрия.
Тиогликолевую среду можно хранить в течение 14 сут со дня
приготовления при температуре от 10 до 25 град. С в защищенном от
света месте.
В случае, если при хранении среды, содержащей резазурин,
верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет,
среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в
течение 10-15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим
быстрым охлаждением. В случае, если окраска не исчезает после
нагревания, среду считают непригодной к употреблению. Регенерацию
среды можно проводить только один раз.
Среда Сабуро:
пептона ферментативного 10 г
глюкозы 40 >>
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 5,6 +/- 0,2
Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении
0,11 +/-0,02 МПа (1,1 +/-0,2 кгс/кв. см) и при температуре (121
+/-1) град. С в течение 15 мин.
Жидкость N 1:
пептона ферментативного 1 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,1 +/-0,2
Жидкость N 2:
пептона ферментативного 5 г
твина-80 10 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,1 +/-0,2
Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так же, как
и питательные среды.
Требования к ростовым свойствам питательных сред.
Тиогликолевая среда и среда Сабуро должны обеспечивать визуально
обнаруживаемый рост соответствующих тест - штаммов аэробных и
анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД).
Используемые питательные среды должны обеспечивать рост
микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100
жизнеспособных клеток: для тиогликолевой среды - не позднее 48 ч
инкубации при температуре от 30 до 35 град. С и для среды Сабуро -
не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 град. С.
ИСПЫТАНИЕ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЧИСТОТУ
Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы,
экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе
производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и
поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту.
Таблица 13
Тест - микроорганизмы, используемые для
определения антимикробного действия лекарственных
средств и ростовых свойств питательных сред
------------------------------------------------------------------
| N по Каталогу | | |
| штаммов | |Питательная |
| Всесоюзного | Тест - штаммы | среда |
|музея патогенных | | N |
|бактерий ГИСК им.| | |
| Л.А.Тарасевича | | |
|-----------------+---------------------------------+------------|
| 010011 |Bacillus subtilis ATCC 6633 | 1 |
| 010014 |Bacillus cereus ATCC 10702 | 1 |
| 240533 |Escherichia coli ATCC 25922 | 3 |
| | | 6 |
| | | 7 |
| 190155 |Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 9 |
| 201108 |Staphylococcus aureus ATCC 6538-P| 10 |
| | | 8 |
|-----------------+---------------------------------+------------|
|N в коллекции | | |
|патогенных | | |
|грибов НИО | | |
|глубоких микозов | | |
|Ленинградского | | |
|ГИДУВ | | |
|-----------------+---------------------------------+------------|
| 259 |Candida albicans ATCC 885-653 | 2 |
------------------------------------------------------------------
Испытание на микробиологическую чистоту включает
количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а
также выявление определенных видов микроорганизмов, наличие
которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.
Испытание проводят в асептических условиях, применяя
приведенные методы и питательные среды для контроля всех видов
нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используемого в
их производстве.
Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, и
консерванты, входящие в состав некоторых нестерильных
лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов
микроорганизмов в условиях проведения испытания.
Во избежание неправильной оценки результатов испытания
определяют действие лекарственного средства в отношении следующих
тест - микроорганизмов: Bacillus subtilis (Bacillus cereus),
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Candida albicans, указанных в табл. 13.
Определение антимикробного действия лекарственного средства.
Пять образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый разводят
в соотношении 1:10 фосфатным буферным раствором рН 7,0 (два
образца), средой N 3 (один образец) и средой N 8 (два образца).
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на
жидкой среде N 1 при температуре от 30 до 35 град. С в течение
18-20 ч, культуру Candida albicans - на жидкой среде N 2 при
температуре от 20 до 25 град. С в течение 48 ч. Культуры разводят
1:1000 стерильным 0,9% раствором натрия хлорида изотоническим,
вносят по 1 мл взвеси каждого тест - штамма (в отдельности) в
приготовленные образцы лекарственного средства в буферном растворе
(Bacillus subtilis, Candida albicans), в среде N 3 (Escherichia
coli) и в среде N 8 (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus). Для выявления микроорганизмов используют методы,
приведенные в данной статье. В случае отсутствия роста тест -
штаммов на соответствующих питательных средах отмечают
антимикробное действие лекарственного средства.
Для устранения антимикробного действия лекарственного средства
используют различные методы: 1) увеличивают разведение
лекарственного средства, взяв больший объем растворителя; 2)
добавляют необходимое количество соответствующего специфического
инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие
лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов
(например, пенициллиназу - для пенициллинов и цефалоспоринов,
пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов); 3)
комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические инактиваторы в
питательные среды, нейтрализующие антимикробное действие
лекарственного средства (например, 4% твина-80, 0,5% соевого
лецитина); 5) если все вышеперечисленные методы неэффективны, а
лекарственное средство растворимо, используют метод мембранной
фильтрации; 6) если в связи с природой лекарственного средства
нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все
вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в
отношении данного тест - штамма неэффективны, этот вид испытания
не проводят.
Отбор и приготовление проб лекарственных средств для
испытаний. От каждой серии лекарственного средства (независимо от
ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из
равных разовых проб, взятых из минимум 10 разных упаковок. Для
одного анализа лекарственного средства используют отдельные
образцы по 10 г (мл) для каждого из описанных далее разделов
исследования. Всего для проведения одного анализа используют 30 г
(мл) лекарственного средства. В том случае, когда возникает
необходимость подтвердить несомненность результатов, проводят
повторное испытание только по данному разделу исследования,
используя образец в количестве 10 г (мл).
Для ряда лекарственных средств (антибиотиков, мягких
лекарственных форм и др.) отбирают от каждой серии среднюю пробу
не менее 15 г, состоящую из равных разовых проб, взятых из не
менее чем 10 разных упаковок. Для одного анализа используют
образцы по 3 г (мл) для каждого раздела исследования. Всего для
проведения одного анализа используют по 9 г (мл) лекарственного
средства. При повторении испытания по одному из разделов
исследования используют образец в количестве 3 г (мл).
Для лекарственных средств в аэрозольной упаковке, пленок
полимерных лекарственных и др. отбор и приготовление проб проводят
согласно указанию в частных статьях.
В зависимости от физических свойств лекарственной формы
образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или
эмульсии:
- твердые лекарственные формы, которые трудно растворяются,
измельчают с помощью соответствующего оборудования и суспендируют
в фосфатном буферном растворе рН 7,0 или соответствующей жидкой
питательной среде, рекомендованной для определенного вида
испытания;
- жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, которые
быстро и практически полностью растворяются в фосфатном буферном
растворе рН 7,0 или соответствующей питательной среде в разведении
1:10, готовят в виде растворов или суспензий;
- мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде,
эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с помощью
стеклянных бус и минимального количества подходящего стерильного
эмульгатора, указанного в соответствующей статье (например,
твин-80), применяя механическое встряхивание и нагревание до
температуры не более 45 град. С в случае необходимости.
Приготовленные разведения образцов используют для определения
общего числа бактерий и грибов в 1 г (мл) лекарственного средства
и установления отсутствия бактерий семейств Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.
Количественное определение микроорганизмов
Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри
диаметром 90-100 мм. Образец лекарственного средства в количестве
10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмульгируют в фосфатном
буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора
(суспензии, эмульсии) был 100 мл. Посевы просматривают ежедневно.
Определение общего числа бактерий. Приготовленный раствор
(суспензию, эмульсию) образца вносят по 1 мл в каждую из двух
пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45
до 50 град. С среды N 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и
переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной
среды N 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно
распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки
переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при температуре от 30
до 35 град. С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают
число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее
значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число
бактерий в 1 г (мл) образца.
Для получения достоверных результатов учитывают только те
чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если при
разведении образца 1:10 нет роста, результаты отмечают следующим
образом: "В 1 г (мл) лекарственного средства (сырья) менее 10
бактерий".
Если число колоний на чашке превышает 300, делают ряд
дальнейших последовательных разведений образца (1:100, 1:1000 и
т.д.), выбирая для посева разведение, наиболее соответствующее
указанному выше уровню.
Определение общего числа грибов. Испытание проводят
двухслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду N 2.
Посевы инкубируют в течение 5 сут при температуре от 20 до 25
град. С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают общее
число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят
среднее значение и, умножая его на показатель разведения, т.е. на
10, вычисляют число грибов в 1 г (мл) образца. В случае, если
число колоний грибов на чашке превышает 300, делают ряд дальнейших
разведений образца. На чашке учитывают все колонии грибов, даже
если их число менее 30.
ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE
Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной
среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35
град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей
на среды N 4 и N 5, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при
температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. Если после
инкубации на средах N 4 и N 5 не будет колоний, соответствующих
морфологической характеристике, данной в табл. 14, считают, что в
образце нет бактерий семейства Enterobacteriaceae.
Колонии, подозрительные по морфологии на принадлежность к
семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со сред N
4 и N 5 на скошенную в пробирках среду N 1 и выращивают при
температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. Из каждой
пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на среды N
6 и N 7. После посева в половину пробирок со средой N 6 вносят по
0,5 мл стерильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при
температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. При наличии
роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды N
6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии
нитритов в среде N 7 судят по появлению красного окрашивания при
внесении в среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые
культуры на наличие фермента цитохромоксидазы.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие
палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию,
ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и
восстанавливают нитраты в нитриты, лекарственное средство
контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 14
Морфологическая характеристика бактерий
семейства Enterobacteriaceae
на диагностических средах
------------------------------------------------------------------
| Диагностическая | N 4 | N 5 |
| среда | агар Эндо |висмутсульфит агар|
|------------------+--------------------------+------------------|
|Характерная |Колонии круглые, малиновые|Черные колонии с|
|морфология колоний|с металлическим блеском|характерным метал-|
| |или без него; розовые,|лическим блеском,|
| |бесцветные, блестящие,|участки среды под|
| |выпуклые диаметром 2-4 мм |колониями окрашены|
| | |в черный цвет; |
| | |зеленовато - бурые|
| | |колонии, светло -|
| | |зеленые, бурые |
|Окраска по Граму |Грамотрицательные неспорообразующие палочки |
------------------------------------------------------------------
ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
PSEUDOMONAS AERUGINOSA И STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной
среды N 8, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35
град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей
на среды N 9 и N 10, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при
температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч.
Если после инкубации на средах N 9 и N 10 не обнаружены
колонии микроорганизмов, соответствующих морфологической
характеристике, данной в табл. 15 и 16, считают, что в
лекарственном средстве нет Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus
aureus. При наличии на среде N 9 характерных для Pseudomonas
aeruginosa колоний грамотрицательных неспорообразующих палочек,
обладающих специфическим запахом и выделяющих сине - зеленый
пигмент пиоцианин в питательный агар, культуру исследуют на
<< Пред. стр. 85 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу