Антитiла молока i сироватки кровi людини: характеристика каталiтичноi активностi та вплив на рiст i виживання клiтин

НАЦРЖОНАЛЬНА АКАДЕМРЖЯ НАУК УКРАРЗНИ

РЖНСТИТУТ БРЖОЛОГРЖРЗ КЛРЖТИНИ

КРЖТ ЮРРЖЙ ЯРОСЛАВОВИЧ

УДК 577.112.7: 576.32/36

АНТИТРЖЛА МОЛОКА РЖ СИРОВАТКИ КРОВРЖ ЛЮДИНИ: ХАРАКТЕРИСТИКА КАТАЛРЖТИЧНОРЗ АКТИВНОСТРЖ ТА ВПЛИВ НА РРЖСТ РЖ ВИЖИВАННЯ КЛРЖТИН

03.00.11 тАУ цитологiя, клiтинна бiологiя, гiстологiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацii на здобуття наукового ступеня

доктора бiологiчних наук

Львiв тАУ 2008

Дисертацiiю i рукопис

Роботу виконано в РЖнститутi бiологii клiтини НАН Украiни та у Новосибiрському iнститутi бiоорганiчноi хiмii СВ РАН.

Науковий консультант: член-кореспондент НАН Украiни

доктор бiологiчних наук, професор,

Стойка Ростислав Степанович,

РЖнститут бiологii клiтини НАН Украiни,

завiдувач вiддiлу регуляцii

пролiферацii клiтин та апоптозу.

Офiцiйнi опоненти: доктор бiологiчних наук, професор,

Сибiрна Наталiя Олександрiвна,

Львiвський нацiональний унiверситет

iменi РЖвана Франка,

завiдувач кафедри бiохiмii;

доктор бiологiчних наук,

Скок Марина Володимирiвна,

РЖнститут бiохiмii iм. О.В. Палладiна НАН Украiни,

головний науковий спiвробiтник

вiддiлу молекулярноi мунологii;

доктор бiологiчних наук,

Заставна Данута Володимирiвна,

РЖнститут спадковоi патологii АМН Украiни,

завiдувач вiддiлу дiагностики спадковоi патологii.

Захист вiдбудеться Вл11В» червня 2008 р. о Вл1400В» годинi на засiданнi спецiалiзованоi вченоi ради Д 35.246.01 в РЖнститутi бiологii клiтини НАН Украiни (79005, м. Львiв, вул. Драгоманова, 14/16).

З дисертацiiю можна ознайомитись у бiблiотецi РЖнституту бiологii клiтини НАН Украiни за адресою: 79005, м. Львiв, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розiсланий Вл8В» травня 2008 р.

Вчений секретар

спецiалiзованоi вченоi ради,

кандидат бiологiчних наук В.М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. РЖмунна система ссавцiв не тiльки забезпечуi захист органiзму вiд шкiдливих чинникiв оточуючого середовища, але й бере участь у регуляцii багатьох бiологiчно важливих функцiй, якi пiдтримують гомеостаз органiзму. Гуморальна iмунна система функцiонуi через продукцiю мiльйонiв варiантiв молекул антитiл (АТ), направлених як проти чужорiдних антигенiв, так i проти антигенiв власного органiзму (аутологiчних антигенiв). Аутологiчнi антитiла (ауто-АТ) iз спорiдненiстю до рiзноманiтних бiомолекул (бiлкiв, нуклеiнових кислот, полiсахаридiв, лiпiдiв) було виявлено як у хворих на аутоiмуннi захворювання, так i в клiнiчно здорових людей. В останнiх описано двi рiзновидностi ауто-АТ: полiреактивнi ауто-АТ (Avrameas et al., 1995) та анти-iдiотиповi ауто-АТ (Jerne et al., 1985). Полiреактивнi ауто-АТ (полi-АТ) сироватки кровi людини, головним чином, представленi IgM або iмуноглобулiнами iнших iзотипiв, що секретуються особливою популяцiiю В-лiмфоцитiв, на поверхнi яких присутнiй бiлок CD5 (CD5+-B-лiмфоцити). Полi-АТ i продуктами недиференцiйованих генiв iмуноглобулiнiв i характеризуються низькою афiннiстю та полiспецифiчнiстю (спорiдненiстю до структурно-вiдмiнних антигенiв). Полiспецифiчнiсть цих ауто-АТ визначаi iх подвiйну фiзiологiчну роль в органiзмi ссавцiв. З одного боку, полi-АТ забезпечують первинну iмунну вiдповiдь органiзму на дiю чужорiдних антигенiв, а з iншого боку, через спорiдненiсть до аутологiчних антигенiв цi антитiла можуть бути задiянi у регуляцiю гомеостазу.

Другою рiзновиднiстю ауто-АТ, якi продукуються в нормi, i антиiдiотиповi АТ (аi-АТ). В основi продукцii аi-АТ лежить здатнiсть iмунноi системи ссавцiв сприймати варiабельнi дiлянки власних антитiл (iдiотипи) як чужорiднi антигени i продукувати вториннi антитiла (аi-АТ), специфiчнi до цих фрагментiв антитiл. Через рецептортАУопосередковану взаiмодiю iз iмунокомпетентними клiтинами аi-АТ беруть участь у клональнiй селекцii лiмфоцитiв в органiзмi ссавцiв. Згiдно з цим механiзмом, спiввiдношення мiж первинними антитiлами i аi-АТ регулюi iмунну вiдповiдь органiзму на чужорiднi антигени. Характерною ознакою аi-АТ i iхня висока специфiчнiсть до антигенних детермiнант антитiл.

На вiдмiну вiд ауто-АТ клiнiчно здорових людей, ауто-АТ, виявленi в органiзмi хворих на аутоiмуннi захворювання, володiють високою специфiчнiстю i високою спорiдненiстю до аутоантигенiв. При цьому антигенна специфiчнiсть ауто-АТ безпосередньо повтАЩязана з типом захворювання та особливiстю його перебiгу. Через взаiмодiю iз аутоантигенами ауто-АТ, безпосередньо або опосередковано, можуть брати участь у розвитку аутоiмунних захворювань, що дозволяi вважати iх молекулярними маркерами, придатними для дiагностики аутоiмунних захворювань та прогнозування особливостей iхнього перебiгу у пацiiнтiв.

РЖмунний статус органiзму вагiтних жiнок i породiль маi ряд суттiвих вiдмiнностей вiд нормального стану. З одного боку, це повтАЩязано зi змiнами в органiзмi вагiтноi жiнки, скерованими на забезпечення iмунноi толерантностi щодо клiтин органiзму плоду, а з другого боку, це повтАЩязано iз особливiстю функцiонування гуморального iмунiтету у породiль, який направлений на забезпечення iмунного захисту новонароджених та на розвиток iхньоi власноi iмунноi системи.

Вiдомо, що змiни у гормональному та iмунному статусi жiнок, повтАЩязанi з вагiтнiстю, пологами та лактацiiю, можуть призводити до розвитку аутоiмунних захворювань (Сervera et al., 2002; Molokhia et al., 2008). Внаслiдок порушення аутоiмунноi толерантностi в органiзмi жiнки зтАЩявляються високоспецифiчнi ауто-АТ та абзими, характернi для хворих на аутоiмуннi захворювання (Buneva et al., 2003).

Таким чином, дослiдження антигенноi специфiчностi та функцiональноi активностi ауто-АТ, якi продукуються в нормi, при аутоiмунних захворюваннях, а також при вагiтностi i лактацii, i актуальними, оскiльки вони дозволяють виявити молекулярнi механiзми, залученi у розвиток аутоiмунних процесiв в органiзмi людини.

Компоненти молозива та молока жiнок дiють не лише як фактори трофiчного забезпечення дитини, але й як чинники регуляцii розвитку дитячого органiзму. Ключову роль у такiй регуляцii виконують бiлки молока, якi можуть впливати на пролiферацiю, диференцiацiю та апоптоз клiтин рiзних типiв. Цитокiни, зокрема iнтерферон i деякi фактори росту, у невеликiй кiлькостi присутнi у молоцi i сироватцi кровi (Канышкова та iн., 2003). РЖншi бiлки, якi задiянi у регуляцii клiтинноi активностi, зустрiчаються, переважно, у жiночому молоцi. До цих бiлкiв, наприклад, належить альфа-лактальбумiн, олiгомернi форми якого здатнi iндукувати апоптоз пухлинних клiтин у присутностi iонiв кальцiю (Hakansson et al., 1995), та лактоферин, який, залежно вiд наявностi iонiв залiза, здатний регулювати пролiферацiю, диференцiацiю чи апоптоз рiзного типу клiтин (Legrand et al., 2008).

Оскiльки лактацiя i частиною репродуктивного циклу жiнки, функцiональна активнiсть iмуноглобулiнiв молозива та молока може вiдображати iндивiдуальнi особливостi стану ii гуморального iмунiтету. У жiночому молоцi виявлено полi-АТ (Vassilev et al., 1996) та високоспецифiчнi ауто-АТ, характернi для хворих на аутоiмуннi захворювання (Brenner et al., 1992; Askanase et al., 2002). Останнi можуть бути задiянi у розвитку аутоiмунних процесiв у дитини.

Важливою функцiональною особливiстю ауто-АТ, виявлених в нормi та при патологii, i iхня здатнiсть каталiзувати хiмiчнi реакцii. Каталiтично активнi ауто-АТ отримали назву абзимiв. Абзими, подiбно до ауто-АТ, виявлених в органiзмi ссавцiв, можна роздiлити щонайменше на два типи тАУ абзими, якi i продуктами недиференцiйованих генiв iмуноглобулiнiв (Paul et al., 2005), та абзими, якi утворюються внаслiдок молекулярноi мiмiкрii антигенiв. Останнi вiдносяться до аi-АТ, якi продукуються за умов, коли антигенними детермiнантами виступають полiпептиднi дiлянки, якi формують каталiтичнi центри ензимiв (Gabibov et al., 2006). Функцii абзимiв в органiзмi людини вивченi недостатньо. Аналiз лiтературних даних вказуi на те, що перший тип абзимiв може брати участь у знешкодженнi вiрусних та бактерiальних антигенiв в органiзмi клiнiчно здорових людей, а другий тип абзимiв може бути задiяний у розвитку аутоiмунних захворювань.

У молозивi та молоцi клiнiчно здорових породiль присутнi обидва типи абзимiв. Перший тип (абзими iз фосфотрансферазною активнiстю) було виявлено тiльки у молоцi жiнок (Kit et al., 1991, 1995; Gorbunov et al., 2000, 2005; Karataeva et al., 2005), тодi як другий тип (абзими iз гiдролiзуючою активнiстю) присутнi як у молоцi клiнiчно здорових породiль, так i у сироватцi кровi хворих на аутоiмуннi захворювання (Nevinsky et al., 2002, 2003). Оскiльки функцiя цих абзимiв в органiзмi залишаiться не зтАЩясованою, дослiдження iх бiологiчноi активностi i важливим для розумiння особливостей функцiонування гуморального iмунiтету у жiнок пiд час вагiтностi i лактацii.

Усе вищесказане свiдчить про актуальнiсть дослiдження антигенноi специфiчностi i каталiтичноi активностi антитiл, а також вивчення впливу цих антитiл на рiст i виживання клiтин.

ЗвтАЩязок роботи з науковими програмами i планами. Роботу було розпочато вiдповiдно до планiв науково-дослiдних робiт лабораторii радiохiмii Новосибiрського iнституту бiоорганiчноi хiмii Сибiрського вiддiлення Росiйськоi Академii Наук у межах напрямку тАЬБиокатализ, структура и функция генатАЭ упродовж 1994-1999 рр. Пiзнiше ii було продовжено у вiддiлi регуляцii пролiферацii клiтин та апоптозу РЖнституту бiологii клiтини Нацiональноi Академii Наук Украiни в межах теми ВлДослiдження процесiв, що вiдбуваються пiд час апоптозу, iндукованого антинеопластичними препаратами з рiзним механiзмом дiiВ» упродовж 2006-2008 рокiв (номер державноi реiстрацii № 0106U002599). Частково роботу було також пiдтримано грантом Росiйського Фонду Фундаментальних Дослiджень за темою: тАЬРоль фосфорилирования лактальбумина человеческого молока в образовании его мультимерных форм, обладающих способностью индуцировать апоптоз раковых, эмбриональных и лимфоидных клетоктАЭ, проект 97-04-49931 (1997-1999 рр) та грантом пiдтримки спiльних проектiв вчених Нацiональноi Академii наук Украiни i Сибiрського вiддiлення Росiйськоi Академii наук за темою тАЬБiологiчно активнi сполуки молока i iх фiзiологiчнi функцiiтАЭ, проект № 9 (2006-2008 рр), якi були наданi здобувачу.

Мета i завдання дослiдженя. Метою роботи було дослiдити взаiмозвтАЩязок мiж антигенною специфiчнiстю та особливостями каталiтичноi активностi ауто-АТ клiнiчно здорових людей та хворих на аутоiмуннi захворювання, а також вивчити iхнiй вплив на рiст i виживання клiтин ссавцiв in vitro.

Для досягнення цiii мети було проведено дослiдження у 3-х основних напрямках:

Порiвняти антигенну специфiчнiсть та каталiтичну активнiсть ауто-АТ, видiлених iз сироватки кровi здорових донорiв та хворих на системний червоний вовчак i розсiяний склероз, iз ауто-АТ, видiленими iз молозива та молока клiнiчно здорових жiнок.

Проаналiзувати спорiдненiсть синтетичних та природних чинникiв, здатних утворювати комплекси iз ауто-АТ сироватки кровi i молока людини, та дослiдити iхнiй вплив на каталiтичну активнiсть абзимiв.

Отримати очищенi препарати антитiл iз рiзною антигенною специфiчнiстю iз сироватки кровi та молока людини i дослiдити iхнiй вплив на рiст та виживання клiтин in vitro.

У межах цих напрямкiв дослiдження у роботi вирiшували наступнi завдання:

Дослiдити вплив препаратiв iмуноглобулiнiв, отриманих iз сироватки кровi здорових донорiв, хворих на розсiяний склероз i молозива породiль, на рiст i виживання клiтин in vitro.

Розробити методи очистки ауто-АТ та абзимiв iз сироватки кровi та молока людини.

Визначити антиген-звтАЩязувальнi, каталiтичнi та регуляторнi центри ауто-АТ та абзимiв iз використанням афiнноi модифiкацii молекул АТ реакцiйно здатними аналогами нуклеотидiв та олiгонуклеотидiв.

Вивчити закономiрностi регуляцii каталiтичноi активностi абзимiв сироватки кровi та молока людини:

а) за допомогою рiзних речовин бiологiчного походження (нуклеотиди, ДНК, РНК, полiсахариди, конкурентнi iнгiбiтори протеiназ);

б) за допомогою синтетичних речовин (модифiкованi аналоги нуклеотидiв та олiгонуклеотидiв, хiмiчнi модифiкатори амiнокислотних залишкiв бiлкiв).

Встановити закономiрностi впливу ауто-АТ та абзимiв, видiлених iз сироватки кровi клiнiчно здорових людей та молока породiль, на рiст та виживання ракових i трансформованих клiтин in vitro.

ОбтАЩiкт дослiдження тАУ аутологiчнi антитiла сироватки кровi i молока людини.

Предмет дослiдження тАУ виявлення i очистка аутологiчних антитiл рiзноi антигенноi специфiчностi iз сироватки кровi i молока людини та дослiдження iхньоi функцiональноi активностi, зокрема, впливу на рiст i виживання клiтин.

Методи дослiдження. У роботi використано методи препаративноi та аналiтичноi бiохiмii бiлкiв i нуклеiнових кислот (осадження бiлкiв сульфатом амонiю, дiалiз, iонообмiнна хроматографiя, електрофорез у полiакриламiдному та агарозному гелi, iзоелектричне фокусування бiлкiв, високоефективна рiдинна хроматографiя). Проведено комптАЩютерний аналiз рiвня гомологii мiж первинними структурами протеiнкiназ та бiлкiв надродини iмуноглобулiнiв. Застосовано методи дослiдження цитотоксичноi дii чинникiв на клiтини ссавцiв in vitro (визначення кiлькостi живих i мертвих клiтин у культурi, виявлення апоптозу електрофоретичним аналiзом нуклеосомноi фрагментацii ДНК та електрофорезом iндивiдуальних клiтин у гелi агарози (метод ДНК-комет)). Крiм того, застосовано iмунологiчнi методи (iмуноензимний i цитохiмiчний аналiз антигенноi специфiчностi антитiл молока людини), а також методи статистичноi обробки результатiв дослiдження.

Наукова новизна одержаних результатiв. На основi розробленоi схеми очистки антитiл iз заданою антигенною специфiчнiстю iз сироватки кровi хворих на аутоiмуннi захворювання (системний червоний вовчак (iВ), розсiяний склероз) та молока клiнiчно здорових жiнок уперше очищено каталiтично активнi антитiла (абзими) класу IgG та IgA зi спорiдненiстю до АТР (анти-АТР АТ), дволанцюговоi ДНК (анти-ДНК АТ) i гiстону Н1 (антигiстоновi АТ). Встановлено, що анти-АТР АТ сироватки кровi хворих на системний червоний вовчак i молока клiнiчно здорових жiнок володiють фосфотрансферазною (протеiнкiназною i лiпiдкiназною) активнiстю, анти-ДНК АТ молока людини володiють РНК-азною, ДНК-азною та протеiнкiназною активнiстю, тодi як антигiстоновим АТ сироватки кровi хворих на розсiяний склероз i молозива породiль властива протеазна активнiсть щодо деяких лужних бiлкiв.

Вперше виявлено чинники, якi впливають на каталiтичну активнiсть абзимiв. Показано, що дезоксирибоолiгонуклеотиди стимулюють протеiнкiназну активнiсть sIgA-абзимiв молока людини, тодi як нуклеотидтрифосфати iнгiбують iхню нуклеазну активнiсть.

Виявлено, що iмуноглобулiни сироватки кровi та молока клiнiчно здорових людей iндукують загибель клiтин лейкемii шляхом апоптозу. Разом iз тим, у сироватцi кровi окремих хворих на розсiяний склероз присутнi iмуноглобулiни, здатнi iндукувати пролiферацiю лейкемiчних клiтин людини.

Теоретичне значення одержаних результатiв. Вперше обТСрунтовано механiзм промiтогенноi дii IgG-абзимiв на клiтини ссавцiв, а також механiзм каталiзу антитiлами фосфотрансферазноi реакцii. Запропоновано модель внутрiшньоклiтинноi нейтралiзацii вiрусiв у епiтелiальних клiтинах за участю sIgA-абзимiв.

Практичне значення отриманих результатiв. У роботi проведено аналiз антигенноi специфiчностi, каталiтичноi та цитотоксичноi активностi iмуноглобулiнiв, отриманих iз молозива клiнiчно здорових породiль. На основi отриманих результатiв зроблено висновок про те, що функцiональнi властивостi iмуноглобулiнiв молозива залежать вiд iндивiдуальних особливостей стану гуморального iмунiтету у породiль. Цi властивостi важливо врахувати пiд час комплексного визначення показникiв раннiх аутоiмунних порушень у жiнок, повтАЩязаних iз iхньою вагiтнiстю та пологами.

Особистий внесок здобувача. Авторовi належить формулювання теми й мети дослiджень, вибiр обтАЩiктiв, а також вибiр i розробка методiв дослiдження, постановка експериментiв. Експериментальнi визначення, обробка даних, iхнiй теоретичний аналiз виконанi автором самостiйно, або за його безпосередньою участю. Автором проведено аналiз даних лiтератури за темою роботи, сформульовано та обТСрунтовано висновки та узагальнення.

Науковим консультантом здiйснювалося загальне керiвництво проведенням дослiджень та обговорення отриманих результатiв у перiод роботи дисертанта в РЖнститутi бiологii клiтини НАН Украiни.

Апробацiя одержаних результатiв. Основнi результати дисертацii обговорювались на РЖРЖ мiжнароднiй конференцii тАЬCatalytic Antibodies and Antibody EngineeringтАЭ (Шантiлi, Францiя, 1996); X мiжнародному iмунологiчному конгресi (Нью-Делi, РЖндiя, 1998); Кiстоунському симпозiумi з молекулярноi i клiтинноi бiологii (Брекенрiдж, США, 1999); III Парнасiвськiй конференцii тАЬMechanisms of cellular signal transduction and communicationтАЭ (Львiв, 2000); Мiжнароднiй конференцii тАЬRNA as Terapeutic and Genomic TargetтАЭ (Новосибiрськ, Росiя, 2001); конференцii НАТО тАЬFrontiers in autoimmunity: fundamental aspects and clinical perspectivesтАЭ (Кеслей, Угорщина, 2002); Установчому зтАЩiздi украiнського товариства клiтинноi бiологii (Львiв, 2004); V Парнасiвськiй конференцii (Киiв, 2005); XI Украiнському бiохiмiчному зтАЩiздi (Харкiв, 2006); РЖРЖРЖ Мiжнароднiй конференцii тАЬФундаментальные науки тАУ медицинетАЭ (Новосибiрськ, Росiя, 2007); РЖРЖ зтАЩiздi украiнського товариства клiтинноi бiологii (Киiв, 2007).

Публiкацii. За темою дисертацii опублiковано 38 наукових робiт, iз них 25 статей у фахових вiтчизняних i мiжнародних журналах, 1 огляд та тези 12 доповiдей на наукових конференцiях.

Змiст та обсяг роботи. Дисертацiя включаi вступ, огляд лiтератури, матерiали i методи, результати власних дослiджень, що складаються iз 9 роздiлiв, аналiз та узагальнення результатiв дослiджень, висновки, список використаноi лiтератури, який нараховуi 300 найменувань. Текст дисертацii викладено на 290 сторiнках машинописного тексту i проiлюстровано 118 рисунками i 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМРЖСТ РОБОТИ

Матерiали i методи дослiдженя. Отримання електрофоретично гомогенних препаратiв антитiл i однiiю iз найбiльш важливих умов дослiдження iхньоi функцiональноi активностi. У першу чергу, це стосуiться каталiтично активних антитiл, якi володiють аналогiчною iз ензимами каталiтичною активнiстю. Видiлення та очистка абзимiв i досить складним завданням. Це зумовлено сукупнiстю факторiв. Вiдомо, що сумарнi препарати iмуноглобулiнiв i полiклональними, складаються iз рiзноманiтних за iзотипом антитiл, якi мають спорiдненiсть до великоi кiлькостi рiзноманiтних антигенiв, серед яких i й ензими. Останнi можуть знаходитися у комплексi iз антитiлами, що може бути причиною артефактiв при дослiдженнi iхньоi каталiтичноi активностi. Тому на перших стадiях очистки ауто-АТ необхiдно вiддiлити антитiла вiд рiзноманiтних антигенiв, у першу чергу вiд бiлкiв. Наступним кроком повинно бути видiлення фракцii антитiл, яка володii спорiдненiстю до антигену тАУ потенцiйного субстрату каталiтичноi реакцii.

На рис.1 наведено узагальнену схему очистки ауто-АТ iз сироватки кровi та молока людини, яка дозволяi отримати препарати антитiл iз заданою антигенною специфiчнiстю, збагаченi каталiтично активними антитiлами.

На першiй стадii очистки iмуноглобулiни осаджували 50% сульфатом амонiю. Це дозволяi вiддiлити фракцiю iмуноглобулiнiв вiд основноi маси бiлкiв сироватки кровi чи молока. Наступна стадiя включаi афiнну хроматографiю на колонцi, яка мiстить протеiн A - або протеiн G - агарозу (або сефарозу). Для видалення домiшок колонки промивали розчинами iз пiдвищеною концентрацiiю NaCl (0,3тАУ0,5 М) у присутностi неiонних детергентiв (NP-40, тритон Х-100). Елюцiю iмуноглобулiнiв iз колонки проводили буфером iз низьким значенням рН (1 M оцтова кислота або 0,1 М глiцин-HCl, рН 2,6). Використання цих сорбентiв дозволяi уже на перших стадiях очистки отримати препарати, якi на 90-95% складаються iз iмуноглобулiнiв. Для подальшоi очистки антитiл або iхнього роздiлення на субкласи (наприклад, sIgA та IgG молозива) використовували iонообмiнну хроматографiю або напiвпрепаративну гель-фiльтрацiю (Невинский та iн., 2000). Препарати антитiл, очищенi таким методом, i електрофоретично гомогенними (рис.1А, Б) i придатнi для видiлення антитiл зi спорiдненiстю до певних антигенiв чи субстратiв каталiтичноi реакцii.

Отриманi препарати iмуноглобулiнiв у подальшому слугували для видiлення моноспецифiчних полiклональних антитiл iз сироватки кровi i молока людини афiнною хроматографiiю на колонках, якi мiстять сорбенти iз ковалентно звтАЩязаними лiгандами. Сорбентами слугували: АТР-сефароза, ДНК-целюлоза, гiстон Н1-сефароза. Залежно вiд спорiдненостi до сорбентiв, антитiла елюювали градiiнтом концентрацii 0тАУ1 М NaCl (анти-АТР IgG сироватки кровi хворих на системний червоний вовчак), 3,5 M MgCl2 (анти-АТР sIgA молозива породiль), 50 мМ NaOH (анти-ДНК sIgA молозива породiль), 0,1 М глiцин-HCl, рН 2,6 (антигiстоновi АТ субкласiв IgG та sIgA сироватки кровi хворих на розсiяний склероз i молозива породiль).

Визначення протеiнкiназноi активностi. Для аналiзу протеiнкiназноi активностi АТ i rsCD4 донором фосфату був [g-32P] ATP (5000 Ki/ммоль, тАЬИзотоптАЭ, Росiйська Федерацiя). Реакцiйне середовище мiстило 0,3 тАУ 3 мкг бiлка,20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5-10 мМ MgCl2, 25 мкКi [g-32P] ATP. У деяких випадках, у реакцiйне середовище додатково додавали АТР, казеiн коровтАЩячого або людського молока. Реакцiю фосфорилювання проводили впродовж 30 хв при 37 В°С i зупиняли додаванням денатуруючого розчину (65 мМ трис-HCl, рН 6,8, 1% Ds-Na, 2% 2-меркаптоетанол, 10% глiцерин) або 10% ТХО. Бiлки роздiляли електрофорезом у 12% ПААГ, або у градiiнтi 6-16,5% ПААГ у присутностi 0,1% DS-Na. Гелi фарбували Coomassie R-250, висушували i пiддавали авторадiографii протягом 20 год.

Визначення лiпiдкiназноi активностi. Для аналiзу використовували препарати IgG i sIgA рiзного ступеня очистки. Реакцiю фосфорилювання проводили у середовищi, яке мiстило 20 мM трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ MgCl2 i 20 мкКi [g-32P] ATP.32Р-мiченi лiпiди екстрагували розчином хлороформ: метанол (2: 1) i роздiляли на пластинi Kieselgel 60 у системi хлороформ: метанол: 7М NH40H (60: 35: 5). Пластину висушивали i пiддавали авторадiографii.

Визначення нуклеазноi активностi. Нуклеазну активнiсть iмуноглобулiнiв визначали згiдно ранiше описаноi методики (Shuster et al., 1992). Як субстрат використовували надспiралiзовану та лiнiйну форми плазмiдноi ДНК, тотальну РНК E. coli або рибосомну РНК клiтин аденокарциноми людини лiнii A549. Для аналiзу зразки, якi мiстили 1-5 мкг бiлка, iнкубували iз 3-5 мкг нуклеiнових кислот у 20 мМ трис-HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 протягом 1 год при 37 В°С. Ефекторами реакцii слугували 0,1-3 мМ АТР або 1 мМ GTP, СТР, TTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Продукти реакцii роздiляли електрофорезом у 1% агарозi у трис-борат-ЕДТА буферi, рН 8,3 у присутностi 0,001% бромистого етидiю. Гель фотографували при ультрафiолетовому освiтленнi.

Визначення протеазноi активностi. Для аналiзу протеазноi активностi АТ субстратами слугували гiстони тимусу теляти i цитохром С (тАЮFermentasтАЭ, Литовська Республiка). Реакцiю гiдролiзу проводили у буферi, який мiстив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5 у присутностi 3 мг/мл бiлка i 0,05 тАУ 0,3 мг/мл АТ упродовж 1-3 год при 37 В°С. Реакцiю зупиняли додаванням у реакцiйне середовище 4-кратного денатуруючого буферу (0,2 М трис-HCl, рН 6,8, 4% Ds-Na, 8% 2-меркаптоетанол, 40% глiцерин) i бiлки роздiляли електрофорезом у 12% ПААГ у присутностi 0,1% Ds-Na. Гелi фарбували Coomassie G-250.

Аналiз каталiтичноi активностi АТ пiсля роздiлення гель-фiльтрацiiю за умов дисоцiацii iмунних комплексiв (рН-шок). Препарати АТ пiддавали гель-фiльтрацii на колонцi розмiром 180 x 5 мм, яка мiстила Toyopearl TSK HW-55 (тАЮToyo SodaтАЭ, Японiя). Бiлки препаратiв АТ попередньо осаджували 50% сульфатом амонiю й осад розчиняли в 0,1 М глiцин-HCl, рН 2,6 або 50 мМ NaOH. Елюцiю бiлкiв проводили цими ж розчинами. Хроматографiчнi фракцii (300 мкл) збирали, нейтралiзували i дiалiзували проти буферу, що мiстив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 М NaCl протягом 18 год. Вмiст бiлкiв аналiзували електрофорезом у градiiнтi ПААГ (7 тАУ 18,5%) у присутностi 0,1% Ds-Na. Для аналiзу каталiтичноi активностi вiд хроматографiчних фракцiй вiдбирали алiквоти (30 мкл), додавали 6 мкг субстрату (плазмiдна ДНК, гiстон Н1) й iнкубували 2 год при 37 В°С. Продукти реакцii роздiляли електрофорезом залежно вiд природи субстрату.

Афiнна модифiкацiя бiлкiв реакцiйно здатними аналогами АТР i олiгонуклеотидiв. Для виявлення АТР - i ДНК-звтАЩязувальних дiлянок на молекулах бiлкiв використовували реакцiйно здатнi похiднi АТР(ClR-Р-ppA) i [g-32P] ATP(ClR-32Р-ppA), а також 32Р-мiчений 14-мiрний дезоксириботимiдилат (ClRCH2NHp(T) 14), якi були синтезованi к. б. н. Якубовим Л.А. (РЖнститут хiмiчноi бiологii i фундаментальноi медицини, Новосибiрськ, Росiйська Федерацiя). Реакцiйною групою слугувала алкiлуюча сполука 4- [(N-2-хлоретил-N-метил) амiно] бензиламiн, приiднана до 5'-кiнцевоi фосфатноi групи олiгонуклеотиду або g-фосфату [g-32P] ATP (рис.2).

Афiнну модифiкацiю бiлкiв (sIgA, rsCD4) проводили у забуференому фiзiологiчному розчинi (ЗФР: 0,14 М NaCl, 10 мМ NaН2РО4, рН 7,5) у присутностi 10 мкМ алкiлуючого реагенту протягом 45 хв при 37 В°С. Конкурентами у реакцii слугували: ДНК тимусу теляти, сумарна РНК E. coli i гепарин у концентрацii 1 мг/мл або 30 мкМ d(T) 14. Пiсля завершення iнкубацii до реакцiйного середовища додавали денатуруючий буфер (2% Ds-Na, 50 мМ трис-НCl, рН 6,8, 4% 2-меркаптоетанол, 20% глiцерин) i бiлки роздiляли електрофорезом у 10% ПААГ у присутностi 0,1% Ds-Na. Гелi висушували i проводили iхню авторадiографiю.

РЖмуноензимний аналiз (РЖЕА). РЖЕА проводили згiдно описаноi нижче методики. Для сорбцii антигенiв у лунки 96-лункового планшету для iмунологiчних аналiзiв вносили 30 мкл розчину, який мiстив 2 мкг гiстонiв або дволанцюгову ДНК у 0,1 М K2CO3/KHCO3, pH 8,6, й iнкубували протягом 18 год при 4 В°С. Лунки промивали (3 рази) 200 мкл буферу А (1% БСА у ЗФР), додавали 15 мкг антитiл у 200 мкл буферу А й iнкубували протягом 2 год при 37 В°С. Лунки тричi промивали 200 мкл буферу А, додавали 50 мкл розчину контАЩюгату бiлок А тАУ пероксидаза хрону ("Sigma", США) у розведеннi 1: 500 й iнкубували протягом 1 год при 37 В°С. Лунки планшету тричi промивали 200 мкл ЗФР у присутностi 0,05% Twin-20 i фарбували розчином дiамiнобензидин/Н2О2 протягом
30 хв при 37 В°С
. Реакцiю зупиняли 1 М ортофосфорною кислотою. Оптичну густину розчину визначали при довжинi хвилi 492 нм на спектрофотометрi NanoDrop ND 1000 (тАЮNanoDrop TechnologiesтАЭ, США). Рiвень ауто-АТ у лунках вираховували за величиною оптичного поглинання розчину забарвлених продуктiв пероксидазноi реакцii. Визначення проводили у трьох паралельних дослiдах.

Клiтини та iхнi культивування. У роботi використовували клiтиннi лiнii, одержанi з колекцii РЖнституту експериментальноi патологii, онкологii та радiобiологii НАН Украiни: Jurkat тАУ лейкемiчнi Т-лiмфоцити периферичноi кровi людини, Namalwa тАУ В-лiмфоцити людини (лiмфома Беркiта); L1210 тАУ лейкемiчнi В-лiмфоцити мишi, L929 тАУ трансформованi фiбробласти мишi. Клiтини культивували у середовищi RPMI-1640 або DMEM (тАЮSigmaтАЭ, США) у присутностi 10% сироватки кровi ембрiонiв ВРХ (тАЮSigmaтАЭ, США) i 50 мкг/мл гентамiцину.

Аналiз цитотоксичноi активностi препаратiв антитiл. Клiтини iнкубували iз препаратами АТ (кiнцева концентрацiя 0,7 мг/мл) протягом 24, 48 або 72 год. Фарбування клiтин проводили 0,1% водним розчином трипанового синього. Кiлькiсть незабарвлених живих i забарвлених мертвих клiтин пiдраховували у гемоцитометричнiй камерi пiд свiтловим мiкроскопом Биолам Р (ЛОМО, Росiйська Федерацiя). РЖндекс життiздатностi (IЖ) визначали за формулою: IЖ = O/C x 100, де О тАУ кiлькiсть живих клiтин у культурi пiд впливом АТ, С тАУ кiлькiсть живих клiтин у культурi у вiдсутностi АТ.

Аналiз субклiтинноi локалiзацii антигенiв ауто-АТ.
Клiтини вiдмивали ЗФР вiд культурального середовища, готували цитологiчнi мазки, фiксували iх метанолом протягом 90 сек i висушували при кiмнатнiй температурi.
Пiсля цього мазки iнкубували з препаратами Ig (розведення 1: 75) при 4 В°C протягом ночi. Пiсля iнкубацii мазки промивали ЗФР двiчi по 10 хв та iнкубували iз FITC-мiченими IgG кози, специфiчними до Н-ланцюгiв IgA людини, або контАЩюгованими iз пероксидазою хрону IgG кролика, специфiчними до Н-ланцюгiв IgG людини (тАЮSigmaтАЭ, США), у розведеннi 1: 50 протягом 1,5 год при 37 В°С. Мазки промивали ЗФР, фарбували флуоресцентним барвником DAPI (1 мкг/мл) протягом 1 хв, знову промивали ЗФР, дистильованою водою i фотографували пiд мiкроскопом Микмед К-2-12 (тАЮЛОМОтАЭ, Росiя) при вiдповiдних довжинах хвилi збудження та емiсii для виявлення флуоресценцii. У випадку, коли для детекцii використовували контАЩюгати АТ iз пероксидазою хрону, комплекси антиген-АТ фарбували розчином дiамiнобензидин/Н2О2 у присутностi 100 мМ NiCl2 протягом 30 хв при 37 В°С i виявляли мiкроскопiiю у видимiй областi спектру.

Видiлення фрагментованоi ДНК та ii електрофорез
у гелi агарози. Клiтини пiсля культивування iз препаратами АТ осаджували центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хв. До осаду клiтин додавали 0,5 мл холодного ЗФР та фiксували, поступово додаючи до суспензii клiтин 5 мл холодного розчину 70% етанолу. Клiтини залишали на 12 год при - 20 В°С (деякi зразки зберiгали при данiй температурi протягом 3-4 тижнiв). Пiсля цього клiтини центрифугували при 2000 об/хв протягом 5 хв. Осад клiтин (2-3 млн. клiтин) ресуспендовували у 40 мкл фосфат-цитратного буферу, який мiстив 192 частини 0,2 М Na2HPO4 та 8 частин 0,1 М лимонноi кислоти, рН 7,8, та залишали при кiмнатнiй температурi на 30 хв. Пiсля центрифугування при 3000 об/хв протягом 5 хв надосадову рiдину переносили у свiжу пробiрку типу Еппендорф та додавали 3 мкл 0,25% водного розчину NP-40 (тАЮSigmaтАЭ, США) та 2 мкл РНК-ази А (розчин 10 мг/мл у водi). Пiсля 1-годинноi iнкубацii при 37 В°С до суспензii додавали 5 мкл протеiнази К (тАЮMerckтАЭ, Нiмеччина) (розчин 1 мг/мл у водi) та iнкубували 1 год при 37 В°С. Пiсля iнкубацii до препарату ДНК додавали 12 мкл буферу, який мiстив 0,25% бромфенолового синього, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50% глiцерину i роздiляли в 1% гелi агарози у присутностi 0,005% етидiю бромiду при напрузi 4 В/см протягом 2 год. Фрагменти ДНК виявляли при ультрафiолетовому освiтленнi i фотографували цифровою камерою Nikon Coolpix 4200.

Мiкроелектрофорез ДНК окремих клiтин у гелi агарози (метод ДНК-комет). Аналiз здiйснювали, як описано (Камiнський та iн., 2005). Для формування гелю, предметнi скельця покривали плiвкою агарози шляхом нанесення 2 мл 1% тугоплавкоi агарози (тАЮServaтАЭ, Нiмеччина) i висушування у термостатi при 37 В°С.40 мкл суспензii клiтин вносили у пробiрку типу Еппендорф i помiщали у водяну баню при 40 В°С, змiшували iз 120 мкл розчину легкоплавкоi агарози (тАЮServaтАЭ, Нiмеччина) (кiнцева концентрацiя агарози становила 0,75%), швидко наносили на теплi предметнi скельця 150 мкл такоi сумiшi i покривали теплим покривним скельцем. Пiсля застигання агарози обережно знiмали покривне скельце i вносили у лiзувальний буфер (2% лаурил саркозинат, 0,5 М ЕДТА, рН 7,5, 0,3 мг/мл протеiнази К). Гелi iнкубували при 4о С упродовж 1 год, а потiм 20 год при 37 В°С. Гелi витримували тричi по 20 хв у буферi ТБЕ (90 мМ трис, 90 мМ борноi кислоти та 2 мМ ЕДТА, рН 8,5), пiсля чого вносили в електрофоретичну камеру i заливали цим же буфером (2-3 мм буферу над скельцем). Електрофорез здiйснювали при напрузi 0,6 В/см протягом 25 хв, причому електричне поле скеровували поперек предметного скельця. Пiсля лужного електрофорезу препарати нейтралiзували у 0,4 М трис-HCl, рН 7,5. Гелi висушували i фарбували водним розчином етидiю бромiду у концентрацii 2 мкг/мл.

КомптАЩютерний аналiз рiвня гомологii послiдовностей амiнокислот iмуноглобулiнiв i рецептора СD4 та протеiнкiназ. Амiнокислотну послiдовнiсть рецептора СD4 та Fc-фрагментiв iмуноглобулiнiв було отримано iз бази даних Swiss-Prot. Для аналiзу рiвня гомологii використовували банк генiв протеiнкiназ KinBase та програми порiвняння Kinom Blast Server (" onclick="return false">

Статистична обробка отриманих результатiв дослiджень. Усi дослiди повторювали 3-5 разiв. У роботi наведено середнi значення величин i стандартнi похибки (MВ±m). Статистичний аналiз проводили, користуючись критерiiм СттАЩюдента (t). Вiрогiдними вважали данi у випадку, коли р≤0,05. Побудову графiкiв та статистичну обробку даних здiйснювали за допомогою комптАЩютерних програм Origin 4.0 та Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛРЖДЖЕНЬ ТА РЗХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив препаратiв антитiл сироватки кровi та молока людини на рiст i виживання Т-клiтин лiнii Jurkat. Аналiз впливу препаратiв сумарних iмуноглобулiнiв (Ig), отриманих iз сироватки кровi 22 хворих на розсiяний склероз (РС), i 25 зразкiв молозива клiнiчно здорових породiль, отриманих осадженням 50% cульфатом амонiю, показав, що залежно вiд донорiв, цi препарати можуть як пригнiчувати, так i стимулювати рiст Т-клiтин лiнii Jurkat in vitro (рис.3). На вiдмiну вiд Ig хворих на розсiяний склероз, препарати Ig, отриманi iз сироватки кровi здорових донорiв, у бiльшостi випадкiв пригнiчували рiст клiтин in vitro. Рiвень гальмування приросту Т-клiтин лiнii Jurkat пiд дiiю Ig здорових донорiв був близьким до рiвня гальмування приросту цих клiтин пiд впливом Ig хворих на розсiяний склероз. При цьому жоден iз 25 препаратiв Ig здорових донорiв не володiв промiтогенною активнiстю щодо Т-клiтин лiнii Jurkat. Спiввiдношення кiлькостi живих i мертвих клiтин у цьому дослiдi вказуi на те, що деякi препарати Ig молозива породiль володiють цитотоксичною активнiстю щодо Т - клiтин лiнii Jurkat.

Гель-електрофорезом iндивiдуальних клiтин (аналiз ДНК-комет), а також електрофоретичним аналiзом мiжнуклеосомноi фрагментацii ядерноi ДНК встановлено, що загибель Т-клiтин лiнii Jurkat пiд впливом цитотоксичних препаратiв Ig молозива породiль вiдбуваiться шляхом апоптозу (рис.4).

Наступне дослiдження показало, що подiбно до Ig молозива породiль, окремi препарати Ig, очищенi iз сироватки кровi хворих на розсiяний склероз i здорових донорiв, також iндукують апоптоз цих Т-клiтин.

Отриманi результати вказують на особливостi впливу препаратiв iмуноглобулiнiв на рiст i виживання Т-клiтин лiнii Jurkat, що може вiдображати iндивiдуальний стан гуморального iмунiтету донорiв. Вiдмiнностi у дii препаратiв Ig щодо клiтин можуть бути повтАЩязанi iз присутнiстю в iхньому складi ауто-АТ певноi антигенноi специфiчностi i каталiтичноi активностi. Особливоi уваги заслуговуi той факт, що дослiдженi препарати сумарних АТ сироватки кровi хворих на розсiяний склероз i АТ молозива прородiль володiли як цитотоксичною, так i промiтогенною активнiстю щодо Т-клiтин лiнii Jurkat. Цi данi вказують на те, що у молозивi людини можуть бути присутнi ауто-АТ, якi за своiю антигенною специфiчнiстю i бiологiчною активнiстю подiбнi до ауто-АТ сироватки кровi хворих на аутоiмуннi захворювання.

Ауто-АТ молозива клiнiчно здорових породiль. Характерною ознакою аутоiмунних порушень в органiзмi людини i поява високоспецифiчних ауто-АТ до ядерних антигенiв тАУ дволанцюговоi ДНК та гiстонiв. За допомогою РЖЕА було проаналiзовано 25 препаратiв Ig молозива породiль на наявнiсть у них анти-ДНК АТ та анти-гiстонових АТ. Як позитивний контроль застосовували препарати IgG сироватки кровi хворих на розсiяний склероз, а як негативний тАУ препарати IgG сироватки кровi здорових донорiв. Встановлено, що вмiст анти-ДНК АТ в усiх препаратах Ig молозива породiль, окрiм препарату Ig № 4, суттiво не вiдрiзнявся вiд вмiсту анти-ДНК АТ у препаратах IgG, видiлених iз сироватки кровi здорових донорiв (рис.5). Вмiст анти-ДНК АТ у препаратi № 4 був достовiрно вищим, нiж в iнших препаратах АТ, хоча у цiлому, вiн був нижчим, нiж у препаратах IgG, видiлених iз сироватки кровi хворих на розсiяний склероз.

Анти-гiстоновi АТ було виявлено у складi 12-ти препаратiв Ig молозива породiль (Рис.5). При цьому у 6-ти препаратах iхнiй рiвень був близьким або перевищував рiвень анти-гiстонових АТ, виявлених у препаратах IgG сироватки кровi хворих на розсiяний склероз. Найвищим вмiстом анти-гiстонових АТ характеризувався препарат № 4, де рiвень анти-гiстонових АТ у 2,5 рази перевищував iхнiй рiвень у препаратах IgG сироватки кровi хворих на розсiяний склероз.

Додатковим пiдтвердженням наявностi ауто-АТ у молозивi породiль можуть слугувати данi аналiзу субклiтинноi локалiзацii антигенiв секреторних iмуноглобулiнiв А (sIgA) у фiксованих препаратах клiтин. За допомогою FITC-мiчених АТ, специфiчних до IgA людини, було виявлено, що препарати сумарних iмуноглобулiнiв молока мiстять s

Вместе с этим смотрят:

РЖсторiя виникнення та розвитку масажу

Аборты

Аденовирусная инфекция

Азотные и кислородные ванны, нафталановая нефть

Акушерська операцiя - накладання акушерських щипцiв