Виробництво бензилпенiцилiну

РЕФЕРАТ

Пояснювальна записка до курсовоi роботи тАЬВиробництво бензилпенiцилiнутАЭ: 29 с., 7 рис., 1 таблиця, 9 лiтературних джерел, 2 додатка.

ОбтАЩiкт дослiдження тАУ технологiя отримання бензилпенiцилiну шляхом мiкробiологiчного синтезу.

Мета роботи тАУ аналiз процесу отримання бензилпенiцилiну шляхом мiкробiологiчного синтезу, опис основних стадiй технологii виробництва антибiотикiв.

Метод дослiдження тАУ аналiз лiтературних джерел, графiчне проектування.

антибiотики, бензилпенiцилiн (пенiцилiн G), 6-апк, Penicillium chrisogenum, безперервний метод стерилiзацii, Кукурудзяний екстракт, фенiлоцтова кислота, фенiлацетамiд, феноксиоцтова кислота, електролiтична коагуляцiя, йонообмiннi смоли, лiофiлiзацiя.

ЗМРЖСТ

ВСТУП

1. Основнi теоретичнi вiдомостi про антибiотики

2. Теорiя бiосинтезу антибiотикiв

3. Технологiя бiосинтезу бензилпенiцилiну

3.1 Характеристика обтАЩiкту бiосинтезу

3.2 Характеристика продуцента

3.3 Пiдготовка посiвного матерiалу

3.4 Характеристика поживного середовища

3.5 Стерилiзацiя поживного середовища

3.6 Особливостi перебiгу процесу ферментацii

3.7 Особливостi процесу видiлення i очистки пенiцилiну

3.8 Контроль якостi отриманого антибiотика

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОРЗ ЛРЖТЕРАТУРИ

ДОДАТКИ

ВСТУП

Одним iз ключових вiдкриттiв ХХ столiття по праву можна вважати зтАЩясування противомiкробних властивостей плiснявих грибiв, зокрема роду Penicillium. Проте iсторiя пошуку препарату, що мiг би врятувати людину вiд багатьох iнфекцiйних захворювань почалась ще задовго до ХХ столiття. В 1871 р. В.А. Манасеiним було встановлено, що зелена цвiль Penicillium glaucum знищуi бактерii, що потрапляють у культуральне середовище. Ця властивiсть Penicillium була тодi ж використана лiкарем А. Г. Полотебневим, що використовував змоченi цiii цвiллю пов'язки для лiкування гнiйних ран i виразок.

Видатне вiдкриття росiйських учених не одержало широкого розповсюдження, i в 1928 р. англiiць Олександр Флемiнг удруге виявив здатнiсть цвiлевого грибка Penicillium пригнiчувати рiст мiкроорганiзмiв. Було показано, що загибель мiкробiв обумовлена невiдомою органiчною речовиною, названою пенiцилiном. Однак видiлення пенiцилiну в чистому виглядi в той же час не було здiйснене, у звтАЩязку iз його термолабiльнiстю, i недосконалiстю методiв видiлення та очищення.

У роки Другоi Свiтовоi Вiйни величезна практична потреба в ефективних антибактерiальних препаратах привернула до пенiцилiну увагу широкого кола фахiвцiв, i приблизно з 1939 р. почався перiод iнтенсивних дослiджень. Завдяки цьому у вiдносно короткий термiн (3 тАУ 5 рокiв) англiйцями Х. Флорi й А. Четтеном (1940) були розробленi способи промислового одержання й очищення пенiцилiну, вивченi його лiкувальнi властивостi й методи клiнiчного застосування, а також встановлена його хiмiчна структура.

Технологiя виготовлення антибiотикiв на початку своii iсторii була дуже примiтивною, iнодi навiть кустарною. Культивування велося поверхневим способом, технологiя очищення була недостатньою щоб отримати препарат високого ступення чистоти. Проте на сьогоднiшнiй день досягнення науки та технiки дозволяють отримувати надзвичайно чистi препарати антибiотикiв, зокрема, за рахунок хроматографiчних, йонообмiнних та мембранних методiв очищення. Значний внесок в пiдвищення якостi препаратiв принесло впровадження технологii напiвсинтеничних антибiотикiв.

Важливо зазначити, що попри велику кiлькiсть створених антибiотикiв, тiльки невелика кiлькiсть знайшла практичне застосування. Пенiцилiн, незважаючи на свою майже столiтню iсторiю, виготовляiться в достатньо великих кiлькостях i на сьогоднiшнiй день.

1. Основнi теоретичнi вiдомостi про антибiотики

бензилпенiцилiн мiкробiологiчний антибiотик

Антибiотики тАУ специфiчнi продукти життiдiяльностi рiзних груп мiкроорганiзмiв, нижчих та вищих рослин i тварин або iх модифiкацii, що володiють високою фiзiологiчною активнiстю по вiдношенню до певних груп мiкроорганiзмiв або злоякiсних пухлин, вибiрково затримують iх рiст або пригнiчують розвиток.

Утворення антибiотикiв тАУ спадково закрiплена особливiсть метаболiзму органiзмiв. Це проявляiться в тому, що кожний вид (або навiть штам) здатний утворювати один або декiлька визначених, строго специфiчних для нього антибiотичних речовин. Метаболiти являються промiжними продуктами обмiну речовин, результатом катаболiчних i анаболiчних реакцiй, кiнцевий продукт обмiну тАУ антибiотики тАУ синтезуються iз первинних метаболiтiв. Разом з тим, один вид антибiотикiв може синтезуватися декiлькома видами органiзмiв. Утворення антибiотикiв зумовлено визначеним характером обмiну речовин, що виник та закрiпився в процесi еволюцii органiзму.

Утворення антибiотикiв тАУ бiологiчний фактор, що маi адаптацiйне значення. Для продуцента здатнiсть до продукцii антибiотикiв важлива не постiйно, а лише в несприятливих умовах, наприклад, у разi нестачi поживних речовин, або у випадку контакту iз специфiчними продуктами життiдiяльностi iншого органiзму.

Специфiчнiсть антибiотикiв характеризуiться:

тАУ високою бiологiчною активнiстю по вiдношенню до чутливих до них органiзмiв, тобто здатнiсть проявляти ефект навiть за низьких концентрацiй;

тАУ вибiрковiстю дii, тобто здатнiстю конкретного антибiотику проявляти свою дiю лише по вiдношенню до визначених органiзмiв або iх груп, не впливаючи на iншi форми живих iстот.

Величину бiологiчноi активностi антибiотикiв виражають в умовних одиницях, що мiстяться в 1 мл (од/мл) або в 1 мг (од/мг) препарату. За одиницю антибiотичноi активностi приймають мiнiмальну кiлькiсть антибiотику, що здатна пригнiтити або зупинити рiст визначеного числа клiтин стандартного штаму тест-органiзма в одиницi об'iму поживного середовища. За одиницю активностi пенiцилiну прийнято мiнiмальну кiлькiсть препарату, здатного затримати рiст золотистого стафiлококу (штам 209) в 50 мл живильного бульйону.

Пригнiчення росту мiкроорганiзмiв антибiотиками може здiйснюватися тiльки за наявностi трьох умов:

тАУ бiологiчно-важлива для життiдiяльностi бактерiй система повинна реагувати на дiю низьких концентрацiй препарату через визначену точку впливу;

тАУ препарати повиннi володiти властивiстю проникати в бактерiальну клiтину i впливати на точку впливу;

тАУ препарат не повинний iнактивовуватися ранiше, нiж вступить у взаiмодiю з бiологiчно активною системою бактерiй [1].

Класифiкацiя антибiотикiв може проходити за рiзними критерiями:

1. Класифiкацiя антибiотикiв за бiологiчним походженням:

а) антибiотики, продукованi мiкроорганiзмами, що належать до еубактерiй;

б) антибiотики, продукованi мiкроорганiзмами, що належать до порядку Actinomycetales;

в) антибiотики, утворенi цiанобактерiями;

г) антибiотики, утворенi недосконалими грибами;

д) антибiотики, утворенi грибами, що належать до класiв базидомiцетiв i аскомiцетiв;

е) антибiотики, утворенi лишайниками, водоростями i нижчими рослинами;

i) антибiотики, утворенi вищими рослинами;

ж) антибiотики тваринного походження.

2. Класифiкацiя за спектром бiологiчноi дii:

а) протибактерiальнi антибiотики вузького спектра дii, активнi переважно по вiдношенню до грампозитивних мiкроорганiзмiв;

б) протибактерiальнi антибiотики широкого спектра дii;

в) протитуберкульознi антибiотики;

г) протигрибковi антибiотики;

д) протипухлиннi антибiотики.

3. Класифiкацiя антибiотикiв за хiмiчною будовою:

а) антибiотики ациклiчноi будови;

б) антибiотики алiциклiчноi будови;

в) тетрациклiни;

г) ароматичнi антибiотики;

д) антибiотики-хiнони;

е) антибiотики-кисневмiснi гетероциклiчнi сполуки;

i) антибiотики-азотовмiснi гетероциклiчнi сполуки;

ж) антибiотики-амiноглiкозиди;

з) металовмiснi антибiотики [2].

Тип дii антибiотикiв може бути цидним (бактерiоцидним, фунгiцидним, вiрiоцидним, протозоацидним), пiд цим розумiiться невiдворотне порушення життiдiяльностi iнфекцiйного агенту, i статичним (бактерiостатичним, фунгiстатичним, вiрiостатичним, протозоастатичним), що спричиняi призупинення життiдiяльностi i розмноження збудника.

Антибiотики повиннi володiти високою вибiрковою токсичнiстю, тобто вони повиннi бути токсичними по вiдношенню до мiкробних клiтин i нешкiдливими до клiтин органiзму хворого.

Залежно вiд точки впливу i механiзму бiологiчноi дii, антибiотики подiляють на:

1. Специфiчнi iнгiбiтори бiосинтезу клiтинноi стiнки: пенiцилiни, цефалоспорини, цефамiцини, ванкомiцин, ристомiцин, циклосерин.

2. Препарати, що порушують молекулярну органiзацiю та функцiонування бiологiчних мембран: полiмiксини, полiiни.

3. Препарати, що пригнiчують синтез бiлку на рiвнi рибосом: макролiди, лiнкоiцини, амiноглiкозиди, тетрациклiни, левомiцетин, фузидин.

4. РЖнгiбiтори синтезу РНК на рiвнi РНК-полiмерази та iнгiбiтори, що дiють на метаболiзм фолiiвоi кислоти: рифампiцини.

5. РЖнгiбiтори синтезу РНК на рiвнi ДНК-матрицi: актиномiцини, антибiотики групи ауреловоi кислоти.

6. РЖнгiбiтори синтезу ДНК на рiвнi ДНК-матрицi: мiтомiцин С, антрациклiни [1].

2. Теорiя бiосинтезу антибiотикiв

Промисловий процес виготовлення антибiотикiв проходить за наступними етапами:

1. Стадii бiосинтезу (утворення) антибiотика. Це основна бiологiчна стадiя складного процесу одержання антибiотичноi речовини. Головне завдання на цiй стадii тАУ створення оптимальних умов для розвитку продуцента й максимально можливого бiосинтезу антибiотика. Висока результативнiсть стадii залежить вiд рiвня бiосинтетичноi активностi продуцента антибiотика, часу його максимального накопичення, складу поживних середовищ для культивування органiзму, у тому числi вмiсту застосовуваних попередникiв, а також загальних енергетичних витрат на процеси, пов'язанi з розвитком продуцента антибiотичноi речовини.

2. Стадii попередньоi обробки культуральноi рiдини, клiтин (мiцелiю) мiкроорганiзму й фiльтрацii (вiддiлення культуральноi рiдини вiд бiомаси продуцента). Ефективнiсть стадii багато в чому визначаiться складом середовища для вирощування продуцента антибiотика, характером його росту, мiсцем основного нагромадження бiологiчно активноi речовини (у культуральнiй рiдини або всерединi клiтини).

3. Стадiя видiлення й очищення антибiотика. На цiй стадii, залежно вiд властивостей антибiотика, його хiмiчноi будови й основного мiсця нагромадження антибiотичноi речовини, застосовують рiзнi методи видiлення й очищення. У якостi основних методiв використовуються екстракцiя, осадження, сорбцiя на йонообмiнних матерiалах, розпарювання, сушiння.

Особливiсть цiii технологiчноi стадii визначаiться тим, що на першiй стадii мають справу з невеликою концентрацiiю (~1 %) антибiотика в оброблюваному розчинi, тодi як на наступних етапах його концентрацiя збiльшуiться до 20-30 %. Усе це вимагаi застосування рiзних мiсткостей i об'iмiв використовуваних реагентiв.

4. Стадii одержання готовоi продукцii, виготовлення лiкарських форм, розфасовки. Особливiсть стадii обумовлюiться дуже високим вимогам до якостi кiнцевого продукту. У випадку випуску антибiотикiв, призначених для iн'iкцiй, препарати повиннi бути стерильними; одержання таких антибiотичних препаратiв, готування рiзних лiкарських форм, дозування (розфасовка) i пакування повиннi здiйснюватися в асептичних умовах. Для максимального виходу антибiотика при культивуваннi продуцента використовують комплекс заходiв, що включають пiдбiр найбiльш сприятливих для цих цiлей поживних середовищ, режимiв культивування органiзму. Весь цей комплекс заходiв включаiться в поняття Влкерований бiосинтезВ».

У промислових умовах керований бiосинтез вимагаi суворого дотримання технологiчного процесу як на стадii пiдготовки iнокуляту, так i на стадii бiосинтезу. На стадii пiдготовки iнокуляту особливу увагу звертають на склад середовища, на якому вирощуiться органiзм, на вiк клiтин або мiцелiю. На стадii бiосинтезу, крiм складу середовища, велику роль вiдiграють швидкiсть споживання тих або iнших компонентiв, вмiст попередникiв, регуляцiя процесу аерацii культури, пiдтримка вiдповiдних температури й рН середовища й iнших показникiв режиму культивування.

У сучасних умовах виробництва вживають заходiв для максимального зниження собiвартостi препаратiв шляхом iнтенсифiкацii всiх стадiй технологiчного процесу й, насамперед, пiдвищенням ефективностi першоi стадii тАУ бiосинтезу антибiотичноi речовини.

Для цього необхiдно:

а) впровадження у виробництво найбiльш високопродуктивних штамiв мiкроорганiзмiв-продуцентiв антибiотикiв;

б) створення й забезпечення найсприятливiших умов розвитку продуцента антибiотика на вiдносно дешевих середовищах;

в) широке використання математичних методiв планування процесу розвитку органiзму й електронно-обчислювальноi технiки з метою оптимiзацii й моделювання умов його культивування, що забезпечують максимальний вихiд антибiотика;

г) застосування сучасного обладнання на всiх стадiях технологiчного процесу з автоматизованими системами, що контролюють основнi параметри розвитку органiзму i стадiй бiосинтезу антибiотика.

Бiотехнологiчний процес одержання антибiотикiв можна зобразити у виглядi наступноi схеми (рис. 1) [2].

Рис. 1. Схема виробництва антибiотикiв в процесi мiкробiологiчного синтезу.

3. Технологiя бiосинтезу бензилпенiцилiну

3.1 Характеристика обтАЩiкту бiосинтезу

В 1871 р. В.А. Манасеiним було встановлено, що зелена цвiль Penicillium glaucum знищуi бактерii, що потрапляють у культуральне середовище. Ця властивiсть Penicillium була тодi ж використана лiкарем А. Г. Полотебневим, що використовував змоченi цiii цвiллю пов'язки для лiкування гнiйних ран i виразок.

Видатне вiдкриття росiйських учених не одержало широкого розповсюдження, i в 1928 р. англiiць Олександр Флемiнг удруге виявив здатнiсть цвiлевого грибка Penicillium пригнiчувати рiст мiкроорганiзмiв. Було показано, що загибель мiкробiв обумовлена невiдомою органiчною речовиною, названою пенiцилiном. Однак видiлення пенiцилiну в чистому виглядi в той же час не було здiйснене, у звтАЩязку iз його термолабiльнiстю, i недосконалiстю методiв видiлення та очищення.

У роки Другоi Свiтовоi Вiйни величезна практична потреба в ефективних антибактерiальних препаратах привернула до пенiцилiну увагу широкого кола фахiвцiв, i приблизно з 1939 р. почався перiод iнтенсивних дослiджень. Завдяки цьому у вiдносно короткий термiн (3 тАУ 5 рокiв) англiйцями Х. Флорi й А. Четтеном (1940) були розробленi способи промислового одержання й очищення пенiцилiну, вивченi його лiкувальнi властивостi й методи клiнiчного застосування, а також встановлена його хiмiчна структура. До пенiцилiнiв вiдноситься група близьких по хiмiчних властивостях сполук, що мiстять у своiй структурi β-лактамне й тiазолiдинове кiльця: (див. рис. 2) [2].

Рис. 2. Структурна формула пенiцилiну.

В пенiцилiнах R може бути представлений рiзними структурами. Найбiльш вiдомий i широко використовуваним i бензилпенiцилiн, або пенiцилiн G, в якому радикал представляi собою бензильний залишок (C₆H₆ тАУ CH₂ тАУ ), в пенiцилiнi V радикалом i феноксиметил (C₆H₆ тАУ О тАУ CH₂ тАУ ) [3].

Спочатку його отримували методом поверхневого культивування. Технологiя була досить примiтивною тАУ продуцент культивували в колбах або пляшках. Потреба в пенiцилi була дуже велика i обтАЩiм його виробництва, хоч i в примiтивних умовах, швидко збiльшувався. Для культивування продуцента використовувались навiть пляшки з-пiд молока, оскiльки були в наявностi машини для iх миття та обробки. В кожну пляшку наливали поживне середовище шаром 1 тАУ 4 см, що забезпечувало необхiднi умови аерацii. Пляши помiщали в спецiальнi кошики, стерилiзували, а потiм охолоджували. Сухi спори або iх водну суспензiю вносили в пляшки пульверизаторами або пiпетками i ферментували протягом 5 тАУ 10 дiб за температури 24 В°С.

На сьогоднiшнiй день у всьому свiтi пенiцилiн отримують так, як i решту антибiотикiв, методом глибинного культивування [4].

Бiльшiсть пенiцилiнiв виготовляють у виглядi натрiiвих або калiiвих солей. Новокаiновi i бензатиновi солi i основою пролонгованих препаратiв пенiцилiну для внутрiшньо-мтАЩязового введення.

В сухiй кристалiчнiй формi пенiцилiновi солi досить стабiльнi протягом тривалого термiну за температури 4 В°С.

На сьогоднiшнiй день бензилпенiцилiн необхiдний не тiльки як медичний препарат, але i як речовина, що i вихiдним продуктом для отримання 6-АПК i в подальшому напiвсинтетичних пенiцилiнiв. РЖз загальноi кiлькостi природних пенiцилiнiв приблизно 35 % використовуються як медичнi препарати, а 65 % тАУ для отримання 6-АПК [1].

3.2 Характеристика продуцента

В якостi продуцента широко використовують культури Penicillium chrisogenum, види Penicillium утворюють спори (конiдii).

До роду Penicillium входять гiфальнi мiкроорганiзми iз септованим мiцелiiм, що утворюi конiдiальнi китицi на септованих конiдiiносцях. Конiдii одноклiтиннi, круглi або овальнi i переважно зеленого кольору (див. додаток 2).

Рiд Penicillium нараховуi близько 900 описаних видiв, систематика яких значною мiрою базуiться на особливостях формування китиць (одномутовчастi, двохмутовчастi, неправильнi). Рiд подiляiться на пiдроди: Eupenicillium, Gliocladium, Scopulariopsis, Paecilomyces, Citromyces.

Penicillium chrysogenum належить до секцii Asymmetrica, пiдсекцii Asymmetrica-Velutina. Колонii на агаризованому середовищi плоскi, бархатистi. Розвинутий повiтряний мiцелiй. З верхньоi сторони колонii синьо-зеленi, iнодi з краплинами жовтого екссудату, з нижньоi тАУ безбарвнi або жовтуватi. Конiдii вiд елiптичних (3,3 × 4 мкм) до округлих (4 мкм), часто зiбранi в тiснi колонки. Конiдiiносцi гладенькi [5].

В розвитку мiцелiю спостерiгаiться ряд рiзних фаз. На початку i в серединi розвитку мiцелiю у клiтинах накопичуються жири. Згодом iх кiлькiсть зменшуiться, зтАЩявляються вакуолi з гранулами рибонуклеополiфосфатiв, потiм починаiться автолiз. РЖнтенсивний синтез пенiцилiну починаiться за наявностi великоi кiлькостi бiомаси мiцелiю, за повного виснаження глюкози i молочноi кислоти в середовищi i за рН, близького до нейтрального.

Пiд час вивчення пенiцилiну встановлено, що серед продуктiв його кислотного гiдролiзу завжди присутня β-диметилцистеiн. Введенням в поживне середовище речовин iз мiченими атомами C¹⁴, N¹⁵, S³² було вивчено механiзм бiосинтезу пенiцилiну.

Прийнято вважати, що бензилпенiцилiнова кислота синтезуiться iз L-цистина, фенiлоцтовоi кислоти i диметилпiровиноградноi кислоти.

Для отримання пенiцилiну спочатку розмножують спори. РЗх можна вирощувати на агаризованих середовищах, в складi яких входить 0,5 % меляси, 0,5 % пептону, 0,4 % повареноi солi, 0,01 % однозамiщеного фосфату калiю i 0,005 % сульфату магнiю. Спори вирощують за температури 25 тАУ 27 В°С протягом 4 тАУ 5 дiб.

В промисловостi спори часто отримують, вирощуючи мiцелiй в скляних флаконах на просяному середовищi. Висушений споровий матерiал можна зберiгати навiть за кiмнатноi температури.

Отриманий споровий матерiал використовують для засiву iнокуляторiв (1 тАУ 3 флакони на апарат, де мiцелiй розмножують до кiлькостi 5 тАУ 10 % вiд обтАЩiму посiвних ферментерiв) [4].

Промисловi штами пiд час селекцii дають невелику кiлькiсть варiантiв, iз яких вiдбирають найбiльш активнi i стабiльнi для подальшого використання. Культури зберiгаються в лiофiлiзованому станi протягом 3 рокiв. Пенiцилiни також можуть синтезувати Penicillium notatum, P. brevicompactum, P. nigricans, P. turbatum, P. steckii, P. corylophylum, Aspergillus flavus, A. janus, A. nidulans [5].

3.3 Пiдготовка посiвного матерiалу

Пiдготовка посiвного матерiалу тАУ одна з найвiдповiдальнiших операцiй у циклi бiотехнологiчного способу одержання антибiотикiв. Вiд кiлькостi i якостi посiвного матерiалу залежить як розвиток культури у ферментерi, так i бiосинтез антибiотика. Продуцент зазвичай вирощують на багатих по складу натуральних середовищах, здатних забезпечити найвищу фiзiологiчну активнiсть мiкроорганiзмiв. Пiдготовка посiвного матерiалу тАУ процес багатоступеневий (мал. 3).

Рис. 3. Схема багатоступеневого приготування посiвного матерiалу А тАУ вирощування у флаконах, Б тАУ вирощування у колбах на качалках: 1 тАУ законсервований вихiдний матерiал; 2 тАУ спорова генерацiя на скошеному агарi в пробiрцi; 3 тАУ II спорова генерацiя на твердому середовищi; 3а i 3б тАУ I i III генерацii на рiдкому середовищi в колбi; 4 тАУ ферментер попереднього iнокулювання; 5 тАУ ферментер iнокулювання; 6 тАУ основний ферментер.

Мiкроорганiзм попередньо вирощують на агаризованому середовищi в пробiрцi (1, 2), потiм iз пробiрки роблять висiв у колби з рiдким поживним середовищем, проводять двi генерацii методом глибинного вирощування на качалках протягом двох-трьох дiб для кожноi генерацii (3а й 3б). РЖз другоi генерацii культури в колбi роблять посiв у невеликий (10 л) iнокулятор 4, пiсля чого добре розвинену культуру переносять у бiльший iнокулятор 5 (100 тАУ 500 л), звiдки й роблять посiв в основний ферментер 6. Для посiву в основний ферментер використовують вiд 5 до 10 % посiвного матерiалу (iнокуляту) [2].

3.4 Характеристика поживного середовища

Для промислового виробництва антибiотика використовують середовище, що мiстить кукурудзяний екстракт, гiдрол, лактозу i мiнеральнi солi. Замiсть кукурудзяного екстракту можуть використовуватися арахiсове борошно, вичавки, борошно iз бавовняного насiння та iншi джерела поживних речовин. Можливiсть широкого використання продуктiв рослинного походження обумовлена тим, що продуцент маi сильнi протеолiтичнi ферменти. В якостi вуглеводiв часто використовують цукрозу або сумiш лактози iз глюкозою у спiввiдношеннi 1:1. Глюкоза може знижувати бiосинтез антибiотика; на середовищах, що мiстять лактозу або цукрозу (в умовах депресii), бiосинтез антибiотика iде активнiше. Важливу роль в процесi босинтезу пенiцилiну вiдiграi сiрка, що мiститься в структурi антибiотику. В якостi джерела сiрки використовують сульфат або тiосульфат натрiю. Надлишок йонiв мiдi не впливаi на рiст гриба, але пригнiчуi синтез пенiцилiну. Ефект пригнiчення бiосинтезу знiмаiться за рахунок додавання в середовище йонiв залiза. Продуцент в якостi джерела фосфору може використовувати не тiльки фосфати, але й фiтати (солi iнозитфосфорних кислот): Penicillium chrisogenum мiстить фермент, що руйнуi фiтин з вивiльненням неорганiчного фосфору [1].

В посiвних ферментерах мiцелiй вирощують 12 тАУ 18 год, 12 тАУ 15 % обтАЩiму культуральноi рiдини використовують для початку основноi ферментацii. Поживне середовище для вирощування мiцелiю i бiосинтезу пенiцилiну готують зазвичай iз кукурудзяного екстракту, лактози, глюкози, мiнеральних речовин i декiлькох препаратiв фенiлоцтовоi кислоти тАУ попередникiв антибiотикiв [4].

Синтез того чи iншого пенiцилiну залежить вiд наявностi специфiчноi речовини в середовищi, iнакше кажучи, попередника, якого мiкроорганiзм включаi в молекулу антибiотика без попереднього розщеплення. Варто вiдзначити, що попередники бiосинтезу пенiцилiну (фенiлоцтова кислота, фенiлацетамiд, феноксиоцтова кислота) за визначених концентрацiй та значень рН середовища проявляють токсичну дiю на продуцента. Фенiлоцтова кислота найменш токсична. Додавання ii в середовище в концентрацii бiльше 500 мкг/мл пригнiчуi рiст мiцелiю, особливо в першi 24 год його розвитку. Фенiлоцтова кислота додаiться в концентрацii вiд 100 до 500мкг/мл через 24 год розвитку продуцента. За таких умов забезпечуiться найбiльший вихiд бензилпенiцилiну, концентрацiю якого через 72 год розвитку може досягнути 500 тАУ 1000 мкг/мл.

Пiд час розвитку гриба без внесення попередника утворюiться близько 45 % бензилпенiцилiну (пенiцилiн G) i близько 53 % пенiцилiну К (радикал п-гептилпенiцилiн). У разi додавання в поживне середовище фенiлоцтовоi кислоти змiнюiться спiввiдношення утворюваних компонентiв в бiк рiзкого збiльшення бензилпенiцилiну, кiлькiсть якого залежно вiд вiку досягаi 75 тАУ 95 % вiд сумiшi пенiцилiнiв. В процесi культивування Penicillium chrisogenum в середовищi, що не мiстить фенiлоцтовоi кислоти, в ньому накопичуються сiрковмiснi сполуки не β-лактамноi природи, наближенi до цистеiну та метiонiну. Додавання в середовище фенiлоцтовоi кислоти сприяi бiльш швидкому метаболiзму сiрковмiсних компонентiв та сполуки β-лактамноi природи [1].

Склад деяких поживних середовищ, що використовуються у промисловостi для основноi ферментацii пенiцилiну, наведено у таблицi 1 [4].

Таблиця 1. Склад ферментацiйних середовищ (в %) для отримання пенiцилiну

3.5 Стерилiзацiя поживного середовища

Для кожного продуцента антибiотика розробляiться оптимальне живильне середовище. Середовище повинне вiдповiдати певним вимогам:

а) забезпечувати максимальний вихiд антибiотика;

б) складатися з вiдносно дешевих компонентiв;

в) мати гарну фiльтруючу здатнiсть;

г) забезпечувати застосування найбiльш економiчних прийомiв видiлення й очищення антибiотикiв.

Стерилiзацiя поживних середовищ у промислових умовах здiйснюiться двома методами: перiодичним i безперервним.

Перiодичний метод стерилiзацii застосовуiться у разi використання невеликих об'iмiв середовища й полягаi в тому, що середовище нагрiваiться до температури 120 тАУ 130 В°С безпосередньо у ферментерах або в спецiальних казанах-стерилiзаторах, витримуiться при цiй температурi протягом 30 тАУ 60 хвилин (залежно вiд об'iму середовища i його складу), пiсля чого охолоджуiться до 27 тАУ 30 В°С.

За час, затрачуваний на нагрiвання середовища до температури, необхiдноi для стерилiзацii, i ii охолодження, знищуiться значне число мiкроорганiзмiв. Ефект стерилiзацii й збереження термолабiльних речовин досягаються в тому випадку, якщо стерилiзацiю проводять за бiльш високоi температури i за коротший промiжок час. Безперервний метод стерилiзацii доцiльно застосовувати при використаннi бiльших об'iмiв середовища. Приготовлене середовище зi спецiальноi посудини за допомогою насоса подаiться в стерилiзацiйну колону, через яку пропускають гостру пару (тиск пари близько 505 Па). Пару подають зверху по внутрiшнiй трубi, що маi щiлиноподiбнi прорiзи, завдяки чому вiн надходить у середовище, швидко ii нагрiваючи. Середовище в колону подаiться знизу й рухаiться по спiралi навколо внутрiшньоi труби.

Середовище, нагрiте в колонi до необхiдноi для стерилiзацii температури (~130 В°С), надходить у спецiальний апарат, де воно витримуiться певний час при температурi 125 тАУ 130 В°С. Час витримки залежить вiд складу середовища й триваi 5 тАУ 10 хвилин. Звiдси стерильне середовище надходить у змiiвиковий холодильник, охолоджуiться до 30 тАУ 35 В°С (на виходi) i надходить у ферментер.

Безперервний метод стерилiзацii маi ряд переваг: можливiсть автоматичного регулювання процесу, швидке й рiвномiрне нагрiвання середовища, забезпечення бiльш повноi стерильностi середовища й iн.

У процесi пiдготовки поживного середовища для отримання бензилпенiцилiну приготовлене середовище пiддають стерилiзацii. Процес ведуть у колонах безперервноi дii. Далi середовище надходить у витримувач, де охолоджуiться протягом певного часу до температури 23 тАУ 25 В°С [2].

3.6 Особливостi перебiгу процесу ферментацii

У сучасних умовах найбiльш перспективним методом вирощування мiкроорганiзмiв-продуцентiв антибiотикiв визнаний метод глибинного культивування. Метод полягаi в тому, що мiкроорганiзми розвиваються в товщi рiдкого поживного середовища, через яке безупинно подаiться стерильне повiтря, i за постiйного перемiшування.

РЖснуi чотири основнi модифiкацii глибинного способу вирощування мiкроорганiзмiв:

1. Перiодичне культивування. У цьому способi весь процес розвитку мiкроорганiзмiв повнiстю завершуiться в одному ферментерi, пiсля чого ферментер звiльняiться вiд культуральноi рiдини, ретельно промиваiться, стерилiзуiться й знову заповнюiться свiжим поживним середовищем. Середовище засiваiться продуцентом, i процес вiдновляiться.

2. Метод вiдбору. Культивування мiкроорганiзмiв здiйснюiться у ферментерах з перiодичним вiдбором частини об'iму культуральноi рiдини i доведенням свiжим поживним середовищем до попереднього рiвня.

3. Батарейний спосiб. Мiкроорганiзми розвиваються в ряду послiдовно з'iднаних ферментерiв. Культуральна рiдина на певнiй стадii розвитку мiкроорганiзму перекачуiться з першого ферментера в другий, потiм iз другого в третiй i т.д. Звiльнений ферментер вiдразу заповнюiться свiжим поживним середовищем, засiяним продуцентом. У цьому способi вирощування мiкроорганiзмiв мiсткостi використовуються бiльш рацiонально.

4. Безперервне культивування. В основi методу лежить принцип безперервного потоку поживного середовища, що дозволяi пiдтримувати розвиток мiкроорганiзму на певнiй стадii його росту. Стадiя розвитку мiкроорганiзму визначаiться тим, що в цей перiод вiдбуваiться максимальний бiосинтез антибiотика або iншоi бiологiчно активноi сполуки. Встановлено, що в умовах безперервного процесу бiосинтезу деяких антибiотикiв можна одержати чудовi результати, якщо процес вести у двi стадii. У першому апаратi батареi пiдтримують високу швидкiсть потоку, що забезпечуi бiльшу швидкiсть росту продуцента антибiотика, для того, щоб одержати високоактивну бiомасу, а в другому апаратi тАУ забезпечують низьку швидкiсть потоку й вiдповiдно невелику швидкiсть росту. Процес безперервного культивування тАУ перспективний напрямок сучасноi бiотехнологii.

Розвиток мiкроорганiзму у ферментерах проходить за суворого контролю всiх його стадiй i точного виконанням регламенту умов розвитку. Велику увагу придiляють пiдтримцi заданоi температури культивування, активноi кислотностi середовища (рН), ступеня аерацii й швидкостi роботи мiшалки. У процесi розвитку органiзму здiйснюють бiологiчний контроль, враховують споживання органiзмом основних компонентiв субстрату (джерела вуглецю, азоту, фосфору), уважно стежать за утворенням антибiотика. Проводити бiологiчний контроль на досить високому рiвнi дозволяi використання сучасного комптАЩютерного забезпечення та автоматизованих систем управлiння.

Велике значення для утворення пенiцилiну маi аерацiя культури. Максимальне накопичення пенiцилiну вiдбуваiться за iнтенсивностi аерацii, що дорiвнюi 1 од. обтАЩiму повiтря за 1 хв. на 1 од. обтАЩiму середовища. Зменшення iнтенсивностi аерацii або надмiрне збiльшення призводять до зниження бiосинтезу пенiцилiну. Важливу роль при цьому вiдiграi перемiшування культури. Так, iз збiльшенням потужностi, що витрачаiться на обертання мiшалки у ферментерi обтАЩiмом 7500 л, швидкiсть споживання лактози збiльшуiться i бiосинтез антибiотика зростаi (рис. 4). Вiд способу перемiшування культуральноi рiдини залежить форма i величина глибинних колонiй, стан яких визначаi мiру здатностi мiцелiю до синтезу пенiцилiну [6].

Рис. 4. Графiк залежностi накопичення пенiцилiну вiд iнтенсивностi перемiшування.

Велику увага в процесi розвитку продуцента у ферментерах звертають на процес пiногасiння. Пiд час продування повiтря через культуру мiкроорганiзму утворюiться пiна, яка суттiво порушуi процес розвитку продуцента антибiотика у ферментерi. Поява великоi кiлькостi пiни обумовлена бiлковими речовинами, що знаходяться у середовищi, i ii високою в'язкiстю, що пов'язано з iнтенсивним накопиченням бiомаси.

Для боротьби з пiною у ферментерах використовують поверхнево активнi речовини: рослиннi олii (соiву, соняшникову), тваринний жир (лярд, китовий жир), а iнодi мiнеральнi олii (вазелiнову, парафiнову), спирти й вищi жирнi кислоти. Нерiдко в якостi пiногасникiв використовують спецiально синтезованi речовини (силiкони, диазобутананкарбамiл та iн.).

Багато речовин (олii, жири, спирти й iн.), використовуванi в якостi пiногасникiв, споживаються продуцентами антибiотикiв як додатковi джерела вуглецевого живлення. При цьому часто спостерiгаiться пiдвищення виходу антибiотика. Однак внесення пiногасника може знижувати швидкiсть розчинення кисню, що, у свою чергу, негативно позначаiться на розвитку мiкроорганiзму i його бiосинтетичну активнiсть.

РЖнодi використовуються механiчнi способи пiногасiння (вiдсмоктування пiни через спецiальнi труби, руйнування пухирцiв пiни сильними струменями рiдини, пари або газу).

Загальна схема виробництва антибiотикiв до стадii видiлення й хiмiчного очищення представлена на рис. 5.

Рис. 5. Схема виробництва антибiотикiв: I тАУ приготування посiвного матерiалу; II тАУ iнокулятори для нарощування посiвного матерiалу; III тАУ стерилiзатор середовища для великого ферментера; IV тАУ установка для бiосинтезу антибiотика; а тАУ стерилiзацiя середовища в колбах; б тАУ охолодження й посiв культури продуцента в колбу; в тАУ рiст культури в станi спокою; г тАУ рiст культури в качалцi; д тАУ iнокулятор зi стерильним середовищем; е тАУ iнокулятор iз середовищем, засiяним культурою продуцента; i тАУ ферментер;

Перша стадiя процесу тАУ вирощування стандартноi колонii штамiв плiсняви Penicillium chrysogenum тАУ проводиться в iнокуляторах на поживному середовищi де процес iде ~30 годин. Пiдготовлений iнокулят переносять у посiвний апарат, об'iм якого ~ в 10 раз бiльше об'iму iнокулятора. У посiвному апаратi знаходиться також стерилiзоване поживне середовище. Процес росту тут iде ~15 тАУ 20 годин, i далi посiвний матерiал подаiться на ферментацiю в бiльшi реактори тАУ ферментери об'iмом до 100 м³. Процес ферментацii триваi ~70 годин за температури 23 тАУ 24 В°С, рН середовища 6 тАУ 6,5 i за iнтенсивноi аерацii (1 од. обтАЩiму повiтря за 1 хв на 1 од. обтАЩiму середовища) [2].

Для стабiлiзацii реакцii середовища використовують крейду. Коли кiлькiсть пенiцилiну досягаi максимуму ферментацiю припиняють. Динамiка утворення мiцелiю, бiосинтезу пенiцилiну i споживання лактози iз середовища зображено на рис. 6.

Рис. 6. Динамiка бiосинтезу пенiцилiну, утворення мiцелiю i асимiляцii лактози: Х тАУ сухий мiцелiй (мг/100 г), Р тАУ концентрацiя пенiцилiну (1000 од./мл), S тАУ концентрацiя лактози (мг/мл).

Пiд час розвитку продуценту пенiцилiнiв тАУ Penicillium chrisogenum тАУ на кукурудзно-лактозному середовищi видiляють три фази.

Перша фаза тАУ рiст мiцелiю, вихiд антибiотика низький. Завжди присутня в кукурудзяному е

Вместе с этим смотрят:

РЖсторiя виникнення та розвитку масажу

Анализ медицинских информационных систем для лечебно-профилактических учреждений санаторного типа

Анатомо-физиологические особенности детей и подростков

Ассортимент лекарственных средств для лечения аллергии

Вiтамiни та iх вплив на здоровтАЩя людини