Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе
ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО
На правах рукописи
ФИРСТОВА Наталья Вадимовна
ВЛИЯНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ОРГАНОВ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОМ СТРЕССЕ
03.00.04 тАУ Биохимия
Диссертация на соискание
ученой степени кандидата
биологических наук
Научный руководитель
кандидат биологических наук
профессор Генгин М.Т.
ПЕНЗА тАУ 1999
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАж.5
ВВЕДЕНИЕтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАжтАж.6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫтАж.тАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАж11
1.1. Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действиятАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж11
1.2. Обмен регуляторных пептидов тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАж.18
1.2.1. Биогенез нейропептидовтАжтАжтАжтАж....................тАжтАжтАж.18
1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАж.30
1.3. Опиоидные пептиды при воздействии стрессорных факторов.тАжтАж..34
1.4. Ферменты обмена нейропептидов при стрессетАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж....тАж41
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯтАжтАж.тАжтАжтАжтАж48
2.1. Материалы исследованиятАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАж..48
2.2. Методы исследованиятАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАж.49
2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина тАжтАжтАжтАжтАж..49
2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стрессатАжтАжтАж.49
2.2.3. Метод определения активности карбоксипептидазы НтАжтАж.тАжтАж50
2.2.4. Метод определения активности ФМi-ингибируемой карбоксипептидазытАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАж..тАж51
2.2.5. Метод определения активности ангиотензинпревращающего ферментатАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАж.51
2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ in vitroтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАж..тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАж.52
2.2.7. Метод определения белка по ЛоуритАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАж..тАжтАжтАжтАж52
2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования..тАжтАжтАжтАж.52
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАж.53
3.1. Региональное и тканевое распределение КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..53
3.1.1. Распределение активности КПНтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАж..тАж53
3.1.2. Распределение активности АПФтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАж..54
3.1.3. Распределение активности ФМi-ингибируемой КП тАжтАж..тАж..55
3.2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМi-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФтАжтАж56
3.2.1. Активность КПН в головном мозге надпочечниках и семенни-ках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стрессатАжтАж.57
3.2.2. Активность ФМi-ингибируемой КП в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса тАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАж..60
3.2.3ВаВаВаВа Активность АПФ в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса тАжтАж..62
3.3.ВаВаВа Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАж.. 65
3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-аргтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..67
3.3.2. Активность ФМi-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалинарг.тАжтАж69
3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-аргтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАж..тАжтАжтАж..тАж72
3.4.ВаВаВа Исследование влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ in vitroтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАж.74
3.5.ВаВаВа Исследование влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМi-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ у крыс на фоне острого эмоционально-болевого стресса.....тАж.тАжтАжтАж..тАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАж..75
3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса.тАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..77
3.5.2. Активность ФМi-ингибируемой карбоксипептидазы при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стрессатАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..80
3.5.3.ВаВаВа Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стрессатАжтАжтАж....тАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАж84
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯтАжтАжтАжтАж88
ВЫВОДЫтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАж114
ЛИТЕРАТУРАтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАж..116
ПРИЛОЖЕНИЕтАжтАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАж.тАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАжтАж..тАжтАж...146
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АПФ- ангиотензинпревращающий фермент
ГГНС- гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГГБ- гисто-гематический барьер
ГЭБ- гемато-энцефалический барьер
ГЭМЯК - гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота
КП - карбоксипептидаза
КПН - карбоксипептидаза Н
ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон инду-
Вацирующий пептид)
САС- симпато- адреналовая система
ФМi- фенилметилсульфонилфторид
ЭБС- эмоционально-болевой стресс
ВВЕДЕНИЕ.
Одной из наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование влияния острых стресс-факторов на организм. Особый интерес вызывает изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Известно, что кратковременное острое стрессирование приводит к экстренной и генерализованной активации ряда физиологических систем, участвующих как в процессах развития (стресс-реализующие), так и в процессах торможения (стресс-лимитирующие) стресс-реакции [4, 5, 21, 29, 33, 116, 121, 125, 144, 145]. Ведущая роль в регуляции функций этих систем принадлежит нейропептидам, веществам, выступающим в организме в роли нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [126, 134, 204, 221, 258]. В ответ на стресс в первую очередь вовлекаются пептиды гипофиза: адренокортикотропин (АКТГ), b-эндорфин, пролактин [136]. Важную роль в адаптации организма к стрессу играют эндогенные биологически активные пептиды - компоненты стресс-лимитирующих систем: вещество Р, пептид, вызывающий дельта сон, энкефалины [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие экстремального фактора, является система эндогенных опиоидных пептидов [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Выраженным антистрессорным действием обладают, в частности, энкефалины [23, 69, 134, 140, 266]. Установлено, что при воздействии стресса содержание опиоидов в структурах мозга, крови и ликворе животных увеличивается [33, 34, 140, 243].
Уровень биологически активных пептидов, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции физиологических и биохимических систем на воздействие стресс-фактора в значительной мере определяется активностью пептидгидролаз тАУ ферментов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [20, 40, 71, 193, 209, 212, 218, 241, 256, 262].
Нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников. На заключительных этапах процессинга регуляторных пептидов, приводящих к образованию их активных форм, принимают участие карбоксипептидазо-Б-подобные ферменты, катализирующие отщепление остатков основных аминокислот - аргинина и лизина - с С-конца предшественников биологически активных пептидов [39, 188, 192, 264, 268]. Одним из основных ферментов генеза таких нейропептидов как энкефалины, вещество Р, АКТГ, окситоцин, вазопрессин является карбоксипептидаза Н (КПН) (Кф 3.4.17.10) [39, 40, 63, 68, 192, 264]. Недавно появились сведения об участии в обмене регуляторных пептидов фермента, активность которого ингибируется фенилметилсульфонил-фторидом - ФМi-ингибируемой КП [49, 53]. Данный фермент обладает сходной с КПН субстратной специфичностью, что же касается биологической роли фермента, то этот вопрос до сих пор остается открытым. Известно, что уровень активных форм энкефалинов и других нейропептидов в организме контролируется также ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ) (Кф 3.4.15.1), участвующим как в процессинге, так и в деградации регуляторных пептидов [66, 180, 183, 196, 209, 259]. Однако, несмотря на столь важную роль этих ферментов в организме, многие аспекты проявления их функциональной активности изучены недостаточно. Практически отсутствуют сведения об эндогенных механизмах регуляции активности этих ферментов, а также их свойствах при различных патологических и функциональных состояниях организма.
Одним из видов воздействия, оказывающим влияние на уровень нейропептидов в структурах мозга и периферических тканях и приводящим к экстренному повышению адаптивных способностей организма животного, является острый эмоционально-болевой стресс (ЭБС) [37, 52, 70, 112, 145]. Увеличение синтеза и секреции многих регуляторных пептидов при развитии стресс-реакции, наряду с инициацией ряда адаптационных механизмов, приводит к истощению нейрогуморальных и ферментативных систем. В связи с этим, одной из наиболее актуальных задач функциональной биохимии и медицины является поиск путей коррекции изменений, возникающих в функционировании ряда физиологических систем при воздействии острых стресс-факторов. Наиболее благоприятным способом устранения и/или ограничения стресс-нарушений является искусственное повышение активности эндогенных стресс-лимитирующих систем за счет экзогенного введения стресс-протективных веществ пептидной природы, в частности энкефалинов [69, 116, 135]. Известно, что выраженным адаптогенным действием обладает предшественник лей-энкефалина тАУ лей5-энкефалин-арг6 [69, 135] Введение извне компонентов стресс-лимитирующих систем способствует не только усилению потенциальных возможностей организма, но и инициации синтеза ряда биологически активных веществ, которые также обладают антистрессорным действием [11, 13, 59, 78, 107, 119, 132].
Одной из основных причин, ограничивающих широкое применение веществ пептидной природы в клинической практике при разного рода стресс-повреждениях, является трудность при прохождении ими гистогематических барьеров (ГГБ), в частности гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) [30, 108]. Показано, что при периферическом введении веществ модуляторного типа, наблюдается общая закономерность: сами вещества не проходят ГЭБ, в то время как их ближайшие предшественники хорошо проникают через гемато-энцефалический барьер и вызывают соответствующие изменения в функционировании физиологических систем [82]. Кроме того, большое значение имеет выбор способа введения исследуемого стресс-протективного вещества. Известно, что одним из наиболее благоприятных способов введения веществ является инстилляция на конъюнктиву глаза [1, 119], поскольку такое введение способствует максимальному проникновению вещества в мозг и практически не травмирует животное.
Введение извне биологически-активных пептидов, их предшественников, а также синтетических аналогов влияет на обмен эндогенных регуляторных пептидов [6, 69, 79, 101, 105, 198], а, следовательно, и на активность ферментов их генеза. Однако механизмы модуляции такого рода биохимических процессов практически не изучены.
В связи с вышесказанным, особый интерес представляет сравнительный анализ изменений активности КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ - ферментов различающихся по своей тканевой локализации и биологической роли, при воздействии острого ЭБС и вещества, корректирующего сдвиги в метаболизме при стрессе тАУ лей5-энкефалин-арг6.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было исследование влияния предшественника лей-энкефалина (лей5-энкефалин-арг6) на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических тканей крыс, подверженных воздействию острого эмоционально-болевого стресса. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследование регионального и тканевого распределения активности карбоксипептидазы Н, ФМi-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс.
2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через различные промежутки времени.
3. Изучение влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ головного мозга, надпочечников и семенников крыс в различные сроки после инстилляции.
4. Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических тканей крыс в динамике острого эмоционально-болевого стресса.
Полученные данные позволят полнее раскрыть роль исследуемых ферментов в механизмах функционирования пептидергических систем при возникновении и развитии стресс-реакции, более детально изучить механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов, а также понять роль протеолитических ферментов - КПН, ФМi-ингибируемой КП и АПФ в развитии адаптационных реакций организма при остром ЭБС, инициированных введением лей-энкефалин-арг.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.ВаВаВа ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ.
Регуляторные пептиды представляют собой полифункциональную группу биологически активных веществ, которым отводится важная роль среди известных природных биорегуляторов [126, 181, 204, 221, 258]. К настоящему времени описано и изучено более шестисот биологически активных пептидов [62], действующих в организме в качестве нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [62, 126, 134, 221]. Они широко представлены в центральной, периферической нервной системе, присутствие регуляторных петидов отмечено также в некоторых биологических жидкостях организма и периферических органах [156, 166, 197, 221].
Важной особенностью действия биологически активных пептидов является способность одних и тех же пептидных молекул вызывать различные как по характеру, так и по месту проявления реакции [62, 174, 184, 204, 271]. Кроме того, было доказано, что один пептид может быть фактором регуляции, как частных метаболических реакций организма, так и глобальных форм системного поведения [29, 35, 51, 62, 199]. Показано, что нейропептиды принимают участие в регуляции таких процессов, как память, обучение [96, 243], сон [117,131, 200, 217, 254], поведение, регуляция аппетита, жажды, дыхания, сексуальная и локомоторная активность, мышечный тонус [51, 162, 164, 204], ощущение боли [29], стресс-реакции [27, 26, 89, 101, 154, 161, 236] и др.
Современная классификация регуляторных пептидов основана на сочетании функционального, структурного и топологического принципов. В настоящее время выделяют около 40 семейств нейропептидов [12].
Самым многочисленным (свыше 30) и разнообразным по функциям и влияниям в организме является семейство опиоидных пептидов.
Обнаружение в мозге высокоспецифичных рецепторов классических непептидных опиатов - морфина и др. позволило начать целенаправ-ленный поиск их эндогенных лигандов. Первые работы по изучению опиоидных пептидов принадлежат А. Голдстайну, Дж. Хьюсу, Х. Костерлицу, С. Снайдеру, Л. Терениусу [211, 258]. В исследованиях Дж. Хьюса и Х. Костерлица в 1975 году впервые из мозга свиньи были выделены и идентифицированы два морфиноподобных кислото-растворимых пентапептида тАУ тир-гли-гли-фен-лей и тир-гли-гли-фен-мет, впоследствии названных лей-и мет-энкефалинами [211].
В экстрактах гипофизов животных было обнаружено присутствие других, более крупных агонистов морфина - b- a- и g- эндорфинов [225, 242, 253]. В настоящее время определена структура практически всех эндогенных опиоидных пептидов. Кроме мозга они обнаружены в легких, кишечнике, сердце, печени, почках, поджелудочной железе, мышцах, а также в биологических жидкостях организма: спинномозговой жидкости, крови [157, 166, 197, 219, 221].
Более детальное изучение эффектов, проявляемых опиоидными пептидами, показало ряд значительных отличий в ответах организма на морфин и опиоидные пептиды [95, 133]. Полученные данные позволили предположить существование более чем одного класса опиатных рецепторов [95]. Сегодня известно 7 основных типов опиатных рецепторов: m-, d-, k-, l-, s-, e-, c- рецепторы [81, 95, 235, 254]. Они представляют собой специфичные к опиоидным пептидам регулирующие центры ферментативных комплексов или ионных каналов, локализованных преимущественно на цитоплазматической мембране соответствующих клеток-мишеней [95, 169, 173, 265].
Показано, что, опиоидные пептиды способны оказывать воздействие на нейрональную активность [15, 139, 159, 198], память [96], поведение [51, 168, 199], участвовать в регуляции процессов восприятия боли [29, 86, 216, 266], эндокринных функций организма [93, 235], иммунных реакций [148, 167, 172, 173, 214, 244], стрессовых воздействий [14, 125, 238], сердечно-сосудистой деятельности [35, 115], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических заболеваний [32, 120, 129,134, 158, 253] и др.
Из большого числа биологических свойств опиоидных пептидов особо следует выделить следующие: действие в весьма низких концентрациях, высокая селективность, отсутствие накопления в организме и низкая токсичность [3, 16]. Отмеченные свойства позволяют использовать опиоидные пептиды в комплексе терапевтических воздействий, направленных на повышение потенциальных возможностей организма при различных функциональных состояниях организма.
Одним из факторов, ограничивающих широкое применение этих пептидов в клинической практике, является сложность при прохождении ими гистогематических барьеров (ГГБ) [82, 108]. ГГБ рассматриваются как сложная физиолого-гомеостатическая система, которая сохраняет постоянство внутренней среды организма в целом и мозга в частности [30, 108]. Известно, что проникновение в мозг большинства исследованных веществ происходит, преимущественно, через стенку кровеносных капилляров [82, 108]. Таким образом, проницаемость ГГБ зависит в большей степени от плотности сети капилляров в структурах, на которые непосредственно наносится исследуемое вещество, то есть от способа его введения в организм [108]. Известно, что максимальное количество вещества проникает в мозг при внутривенном, внутриартериальном, а также внутрижелудочковом введении, внутримышечное и внутрибрюшинное введение показывают меньший эффект [108]. Обнаружено, что достаточно эффективно вещества проникают через гемато-офтальмический барьер (ГОБ) [1, 24, 30].
Особое место в ряду опиоидных пептидов отводится энкефалинам. В отличие от эндорфинов они широко распространены как в мозге, так и в периферических тканях [34, 172, 185, 197, 212]. Иммуногистохимическими методами энкефалин-содержащие клетки и их терминали были обнаружены в ядрах среднего мозга, ретикулярной формации, ядрах гипоталамуса, лимбической системе, продолговатом мозге, таламусе, желатинозной субстанции спинного мозга [84, 156, 212]. Радиоиммунохимические исследования показали максимальное содержание энкефалинов в бледном шаре и хвостатом ядре, далее в порядке убывания в гипоталамусе, гипофизе, среднем мозге, таламусе, продолговатом мозге, гиппокампе, коре [14, 96, 147, 185]. Среди периферических органов высокое содержание энкефалинов отмечено в надпочечниках, где они сосредоточены преимущественно в мозговом слое [34], поджелудочной железе, печени [219], семенниках [197].
Работы первых исследователей были посвящены изучению преимущественно анальгетического действия энкефалинов [165]. Обнаружено, что введение опиоидных пептидов вызывает эффект обезболивания или снижения порога болевой чувствительности [75, 86, 165, 228]. Анальгетическое действие пептидов реализуется преимущественно через δ-рецепторы гипоталамуса, стриатума и спинного мозга [86, 237, 271].
Достаточно детально исследовалось участие эндогенных энкефалинов и эндорфинов в патогенезе психических и неврологических заболеваний [32, 36, 134]. Предполагается, что опиоидые пептиды участвуют в патогенезе шизофрении и депрессии [216]. Показано, что при депрессиях отмечается снижение опиоидов в организме, а их системное введение приводит к временному улучшению состояния депрессивных больных [216]. Сходство эффектов опиоидных пептидов с действием нейролептиков позволило предположить, что причиной психо-патологических состояний может быть нарушение образования или чрезмерной инактивации этих регуляторных пептидов [114]. Многогранная нейротропная активность энкефалинов и эндорфинов дает основание считать, что они могут играть определенную роль в нейрохимических механизмах действия различных нейортропных препаратов, в том числе и антидепрессантов [114, 120]. Показанное изменение содержания эндогенных опиоидных пептидов и влияние их экзогенного введения было обнаружено и у больных, предрасположенных к наркомании и алкоголизму [32, 64].
Иммуногистохимическими методами была выявлена высокая концентрация опиоидов в зонах мозга, осуществляющих центральную регуляцию кровообращения [35]. Дальнейшие исследования показали участие эндогенных энкефалинов в деятельности сердечно-сосудистой и дыхательной системы [104, 273], в регуляции артериального давления через систему ренин-ангиотензин [87].
Обнаружение опиатных рецепторов d- и k- классов на иммуноцитных мембранах, показало, что энкефалины являются активными регуляторами иммунных реакций [93, 148, 152, 173, 244], осуществляя свое действие посредством активации Т-лимфоцитов мембран [172]. Экспери-ментальные работы ряда авторов подтвердили модулирующее действие энкефалинов на защитные механизмы в периферических и, в особенности воспаленных тканях [214].
Присутствие высоких концентраций опиоидных пептидов в гипоталамусе и надпочечниках [34, 156], связанных с реализацией ряда эндокринных функций в организме, позволило предположить участие энкефалинов и эндорфинов в регуляции действия эндокринной системы [15, 159, 176]. Показано, что энкефалины и эндорфины влияют на секрецию гормона роста, меланостатина, тириоидного гормона [15, 172]. Кроме того, известно, что через опиатные пути осуществляется связь между иммунной и эндокринной системой, что дает возможность диагностировать специфические заболевания, которые имеют в своей основе нейроэндокринные и иммунные расстройства [93].
Данные ряда исследователей указывают на влияние энкефалинов на двигательную активность и поведение крыс [51, 168, 199]. Обнаружено, что опиоидные пептиды, вводимые в высокой концентрации внутрь мозга, вызывают состояние тонической неподвижности. Введение этих пептидов в более низких концентрациях влечет за собой менее глубокие изменения локомоторной активности у крыс, и характеризуется первоначальной фазой снижения активности и последующим периодом гиперактивности. Минимальные концентрации опиоидных пептидов вызывают стимулирующий эффект.
Различная локализация по отделам мозга и периферическим тканям лей- и мет-энкефалинов свидетельствует о возможном различии в функциях этих опиоидных пептидов в регионах [62, 242]. Использование различных методов введения энкефалинов позволяет полнее представить картину влияния их на физиологические процессы в организме. Так, например, при внутрижелудочковом введении было получено подтверждение того, что мет-энкефалин проявляет более выраженное анальгетическое действие, чем лей-энкефалин [29, 75]. Мет-энкефалин также является более действенным иммуностимулятором [214]. Наиболее выраженный наркотический и эйфоригенный потенциал напротив свойственен лей-энкефалину, мет-энкефалин практически не проявляет таких свойств [32].
Столь широкий спектр эффектов опиоидных пептидов связан не только с гетерогенностью опиатных рецепторов и разнообразной локализацией их в организме, но и с тем, что опиоидные пептиды могут реализовывать свое действие и посредством функциональных связей с различными биологически активными веществами, в частности, с регуляторными пептидами других семейств [125, 239, 240] и биогенными аминами [31].
Известно, что энкефалины в отличие от эндорфинов быстро разрушаются аминопетидазами тАУ время полужизни энкефалинов в крови крыс при введении их in vivo составляет примерно две минуты [20, 166, 189]. Однако согласно данным современных исследований, физиологи-ческое действие короткоживущих пептидов может быть достаточно продолжительным [11, 78, 107, 117]. Подобные эффекты описаны для энкефалинов, ПВДС и др [11, 13, 117]. Основной из гипотез, объясняющих пролонгированное действие регуляторных пептидов, признана концепция Ашмарина И.П. о регуляторном континууме [11, 13, 78]. Предполагается, что экзогенно введенные или эндогенно синтезированные, при каком-либо воздействии, регуляторные пептиды, являются своеобразными индуктора-ми для высвобождения ряда других регуляторных пептидов [11, 13, 78, 107].
Таким образом, экспериментальные данные указывают на то, что опиоидные пептиды могут оказывать разнообразное фармакологическое и физиологическое влияние не только на центральную нервную систему, но и на множество других функциональных систем организма. Подобное воздействие осуществляется как непосредственно - через опиатные рецепторы соответствующих клеток-мишеней, так и путем формирования сложных регуляторных цепей и каскадов образования других регуляторных пептидов.
Степень реализации тех или иных эффектов опиоидных пептидов зависит от уровня активных форм эндогенных пептидов, который определяется активностью ферментных систем обмена нейропептидов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [2, 65, 189, 204, 218, 257, 262, 268].
1.2. ОБМЕН РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ.
1.2.1. Биогенез нейропептидов.
Выделяют два возможных пути образования нейропептидов [55, 89]. Один из них нерибосомальный, биосинтез при этом осуществляется с участием специфических ферментов-синтетаз. Другой путь связан с рибосомами, локализованными на мембранах шероховатого эндоплазма-тического ретикулума. В этом случае нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников, которые преобразуются в активную форму в результате ограниченного протеолиза [71, 229, 268]. Более детальное изучение молекулярно-биологических характеристик опиоидных пептидов позволило установить некоторые закономерности их образования. Так к настоящему времени показано существование трех высокомолекулярных белковых предшественников, которые являются источниками всех известных опиоидных пептидов: проопиомеланокортин, проэнкефалин и продинорфин [268]. Каждый из них закодирован отдельным геном в молекуле ДНК [268].
Для всех нейропептидов характерно наличие ряда общих особенностей в структуре и процессинге препропептидов :
n наличие с N-конца сигнальной последовательности, состоящей из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Функция ее состоит в обеспечении транслокации синтезируемого пептида через мембраны шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [71, 268]. В полости ЭПР отщепление этой последовательности осуществляется при участии эндоолигопептидазы - сигнальной пептидазы, которая специфична для определенной последовательности гидрофобных аминокислот [268];
n в структуре предшественников, биологически активные пептиды ограничены парами остатков аргинина и лизина, по которым происходит расщепление [71,268], причем расщепление может происходить не по всем парам остатков основных аминокислот. В связи с этим следует предполагать наличие многообразия и высокой специфичности эндопептидаз к участкам расщепления;
n предшественники нейропептидов могут содержать несколько копий различных пептидов. Например, проопиомеланокортин содержит в своей структуре последовательности мет-энкефалина, адренокортикотропина, a-меланотропина, b-липотропина и b-эндорфина, причем в разных отделах один и тот же предшественник может стать источником различных активных пептидов. Это характерно, например, для предшественника энкефалина в мозге и надпочечниках [272].
Эндопептидазы процессинга представляют собой достаточно большую группу ферментов [171, 203, 227, 267]. На основе их субстратной специфичности выделяют следующие группы:
1) эндопептидазы специфичные для пар остатков основных аминокислот (сериновые, аспартильные, тиоловые);
2) эндопептидазы, расщепляющие связи при единичных остатках основных аминокислот (тиоловые, металлопептидазы);
3) эндопептидазы, расщепляющие пропептиды не по основным остаткам аминокислот (тиоловые, металлопептидазы );
4) высокомолекулярные мультиферментные протеазы;
Следует отметить, что некоторые из эндопептидаз обладают очень узкой субстратной специфичностью, что важно для генеза структур пептидной природы.
Результатом действия эндопептидаз являются неактивные пептиды, содержащие со стороны С- или N-конца остатки аргинина или лизина, которые затем удаляются экзопептидазами с карбоксипептидаза-Б- и аминопептидаза-Б-подобной активностью [208, 229, 268]. Образующиеся в результате биологически активные пептиды, под влиянием какого-либо стимула выбрасываются из клетки либо в кровяное русло, либо в синаптическую щель и мигрируют к клеткам-мишеням, где происходит их связывание со специфическими рецепторами.
По локализации ферменты обмена нейропептидов делят на две большие группы [48]:
1. Ферменты секреторных везикул и эндоплазматического ретикулума (карбоксипептидаза Н (Кф 3.4.17.10), аминопептидаза-В-подобный фермент и др). Эти ферменты участвуют в образовании активных форм нейропептидов.
2. Ферменты вневизикулярной локализации тАУ внеклеточной жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран тАУ ангиотензинпревращающий фермент (Кф 3.4.15.1), карбоксипептидаза N (Кф 3.4.12.7), различные аминопептидазы и др. Роль ферментов вневизикулярной локализации состоит не только в образовании активных форм нейропептидов, то есть процессинге, но и в инактивации нейропептидов.
Таким образом, основную роль в регуляции уровня активных нейропептидов, а, следовательно, и в запуске реакций их биологического действия, играют ферменты конечной стадии процессинга и инактивации [189, 209]. Особого внимания в этой связи заслуживают основные КП, поскольку эти ферменты участвуют не только в конечной стадии образования активных пептидов, но и в начальных стадиях их деградации.
Ключевую роль в генезе нейропептидов мозга играет КПН - фермент секреторных везикул, отщепляющий остатки аргинина и лизина с С-конца неактивных пептидов [187, 193, 195, 248]. Известно, также, что данный фермент может участвовать в начальных стадиях инактивации активных пептидов, содержащих остатки основных аминокислот с С-конца молекулы [40, 248].
Недавно в лаборатории нейрохимии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г.Белинского в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки была обнаружена новая экзопептидаза, отщепляющая остатки аргинина с С-конца синтетических аналогов энкефалинов [49, 53]. Активность этой основной КП полностью ингибировалась фенилметилсульфонилфторидом (ФМi), в связи, с чем фермент был назван ФМi-ингибируемой КП [49]. Особенности тканевого и регионального распределения фермента позволяют отнести ФМi-ингибируемую КП, к ферментам, которые наряду с КПН вовлекается в обмен регуляторных пептидов [48, 53].
Известно, что важную роль в обмене таких биологически активных пептидов как энкефалины, ангиотензины, АКТГ, ПВДС, вещество Р и др. играет ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), участвующий не только в процессинге, но и в инактивации активных форм пептидов [180, 182, 183]. В последнее время особое внимание исследователей обращено на исследование АПФ мозга.
Ниже представлены сведения о физико-химических свойствах этой группы ферментов.
КАРБОКСИПЕПТИДАЗА Н (Кф 3.4.17.10).
Карбоксипептидаза Н (КПН, энкефалинконвертаза, КПЕ) была впервые выделена из хромаффинных гранул надпочечников быка Fricker и Snyder в 1982 году [192, 193]. Позднее КПН была обнаружена и выделена из различных органов и тканей [191, 194, 203, 206, 230]. При этом было показано, что каталитические и физико-химические свойства КПН из различных источников были достаточно близки.
Фермент является гликопротеином и состоит из одной полипептидной цепи, максимальную активность проявляет при рН 5,6-6,0, что соответствует рН внутри секреторных гранул, Мr50-55кДа [40, 192, 193]. Показано также, что КПН является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+ [189]. Фермент активизируется ионами Co2+ и Ni2+, ингибируются ЭДТА, реагентами на сульфгидрильные группы и органическими кислотами, в состав которых входят амино- или гуанидиновые группы при последнем атоме углерода (GEMSA- гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота, GPSA - гуанидинопропилянтарная кислота, APMSA тАУ аминопропилмеркапто-янтарная кислота и 2 меркапт- 3 гуанидинтиопропановая кислота) [256].
Предложены различные методы определения активности КПН. Наиболее широко применяется метод Fricker и Snyder [194], с использованием дансилированных трипептидов тАУ дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг тАУ в качестве субстратов. Для определения активности КПН предложены также даларгин [127], лей5-энкефалин-арг6 [127], [3Н]-бензоил-фен-лей-арг [247], [3Н]-бензоил-фен-ала-арг [247]. Количественное определение КПН в тканях производится методом связывания [3Н]ГЭМЯК [263].
ВаСогласно первоначальным исследованиям фермент представлен в организме двумя формами - растворимой и мембраносвязанной, которые отличаются по величине Мr [187, 193, 205, 264], значение которой для мембраносвязанной формы выше. Такое отличие связывали с наличием у мембраносвязанной формы С-концевой тАЬякорнойтАЭ последовательности, состоящей из 15-20 гидрофобных аминокислотных остатков, основное назначение которой состоит в обеспечении рН - зависимой ассоциации КПН с мембранами. Показано также, что активность мембраносвязанной КПН намного меньше активности растворимой формы данного фермента [189, 264]. Было выдвинуто предположение, что фермент, связанный с мембранами секреторных гранул, является предшественником растворимой формы КПН и превращается в нее в результате протеолитического расщепления связи c C-конца у основания тАЬякорнойтАЭ последовательности. Показано, что при этом активность фермента возрастает в 2-3 раза [186]. По мнению ряда авторов, такое различие в активностях мембраносвязанной и растворимой форм КПН может быть связано ассоциацией менее активной формы с компонентами мембран [71], что ставит под сомнение гипотезу о зависимости активности мембраносвязанной формы от наличия гидрофобной тАЬякорнойтАЭ последовательности.
В дальнейшем было обнаружено, что фермент, связанный с мембраной секреторных гранул отличается от растворимой формы не только по величине Мr, но и по локализации. Так в хромаффинных гранулах надпочечников, в мозге, передней и промежуточной доле гипофиза преобладает растворимая форма КПН, а мембраносвязанная форма локализована преимущественно в задней доле гипофиза [37, 40, 186]. В связи с этим, было высказано предположение, что описанные формы КПН участвуют в процессинге различных по своей функциональной роли пептидов: растворимая КПН принимает участие преимущественно в образовании секреторных пептидов, в то время как мембраносвязанная форма участвует процессинге пептидов, обладающих местным действием [40, 65].
Тканевая, региональная, клеточная и субклеточная локализация фермента была изучена с применением флюориметрических и радиометрических методов определения активности КПН. Наиболее высокая активность КПН обнаружена в хромаффинных гранулах надпочечников, аденогипофизе и островках Лангерганса поджелудочной железы [191, 194, 203, 206]. Более низкая - в задней доле гипофиза, стриатуме, гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [37, 149, 194]. Самая низкая активность КПН отмечена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, сердце, легких, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [149]. Установлено, что фермент локализован в хромаффинных гранулах надпочечников, нейронах мозга, содержащих вещество Р, энкефалины и другие нейропептиды, гормон-продуцирующих клетках гипофиза, a- и b- клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, продуцирующих инсулин и глюкагон [189, 192, 194, 248, 256]
Вместе с этим смотрят:
Анатомическое строение растений
Анатомия и физиология заднего мозга. Строение и механизм кровообращения
Анатомия человека
Анатомо-физологические механизмы безопасности и защиты человека от негативного воздействия
Бiологiчне рiзноманiття людських рас