Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы
Почва является основным депо разнообразных микроорганизмов на Земле [1;10]. Известно, что 60тАУ90 % биомассы Земли представлено микроорганизмами, населяющими, главным образом почву [2], причем их численность в почве, по сравнению с другими природными средами, выше на несколько порядков [3].
Микроорганизмы распределяются по всему почвенному профилю вплоть до подстилающей породы [1;10]. Значительный практический и теоретический интерес представляет вопрос о том, как изменяется численность микроорганизмов по почвенному профилю, а также динамка численности микроорганизмов в нижнем почвенном горизонте в силу новизны самой проблемы. Особенно это касается недостаточно исследованных почв, имеющих в своем профиле оглеенные горизонты.
В анаэробных условиях при участии гетеротрофных бактерий, использующих органическое вещество, при постоянном или периодическом увлажнении идет один из интересных почвообразовательных процессов тАУ глееобразование [2;8]. Этот процесс сопровождается восстановлением Fe(III) до Fe(II) и выносом Fe(II)-соединений в нижние горизонты почвенного профиля. Глееобразование практически всюду может происходить в результате антропогенной деятельности, если она приводит к переувлажнению почв.
В условиях застойно-промывного режима в результате глееобразования происходит максимальный вынос не только железа, но и других металлов тАУ марганца, алюминия, кальция, магния [8;9]. Изучение особенностей микроорганизмов глеевых почв весьма актуально, так как при антропогенном воздействии на почвенный покров, в том числе при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами, подобные почвы встречаются практически повсеместно. В Ярославской области почвы с различной степенью оглеения занимают около 18,3 %, что составляет 662,5 га земель [8].
Почвенные микроскопические грибы и бактерии являются практически единственными деструкторами органического вещества, поступающего в почву в виде растительного опада, мертвых животных, а также органических ксенобиотиков [4;9]. Важным микробиологическим показателем состояния почвы является соотношение численности бактерий двух физиологических групп, которые входят в функциональную структуру почвы: сапротрофов и олиготрофов [2;3]. Сапротрофы разлагают разнообразные органические соединения в значительной концентрации, попадающие в почву. Олиготрофы способны ассимилировать органические соединения в условиях их низкой концентрации, при этом они разлагают остаточные количества органических соединений, ВлрассеивающиесяВ» в почве при деятельности сапротрофов и автохтонных микроорганизмов, разлагающих почвенный гумус [1;3].
Целью работы было изучение динамики численности бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы.
Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить общую численность бактерий в 5 горизонтах почвенного профиля дерновой альфегумусовой глеевой почвы путем прямого счета по методу Виноградского-Брида.
2. Определить численность сапротрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.
3. Определить численность олиготрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.
4. Проанализировать полученные данные по общей численности, численности сапротрофов и численности олиготрофов.
1 Материалы и методы исследования
1.1 Объект исследования и подготовка образцов почвы
к микробиологическому исследованию
Объектом исследования служили пять образцов дерновой альфегумусовой глеевой почвы, отобранной в 5 км от поселка Дорожный Ярославского района Ярославской области. Охарактеризуем горизонты по мере увеличения глубины их залегания:
1. почвенный образец взят из темногумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 7 тАУ 12 см, цвет темно-серый, структура зернистая, наблюдается обилие мелких корней;
2. образец взят из горизонта темногумусового с признаками оглеения почвенного разреза. Глубина 12 тАУ 16 см, цвет темно-серый, наблюдаются мелкие серые, рыжие и сизые пятна, в качестве включений представлены мелкие корни, механический состав определяется как среднесуглинистый;
3. образец взят из светлогумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 16 тАУ 23 см, цвет серый, наблюдаются рыжие и сизые пятна, механический состав определяется как среднесуглинистый, структура зернисто-комковатая, в качестве включений представлены мелкие корни;
4. образец взят из иллювиально-гумусово-железистого горизонта почвенного разреза. Глубина 25 тАУ 45 см, преобладающий цвет светло-бурый с многочисленными охристыми, сизыми и голубыми затеками и пятнами; до глубины 45 см заметны затеки гумусового вещества; горизонт плотного сложения, сильно увлажнен; механический состав определяется как легкоглинистый;
5. образец взят из глеевого горизонта почвенного разреза. Глубина 45 тАУ 70 см, цвет темно-серый, присутствуют кирпично-красные включения; горизонт более уплотнен, с глубины 70 см просачивается вода.
Подготовку почвенных образцов проводили согласно существующим рекомендациям [7].
1. Почву высыпали на сухое стекло, тщательно перемешивали и раскладывали ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляли мелкие корешки и другие посторонние включения. Из разных мест рассыпанной почвы отбирали небольшие порции и взвешивали на технических весах по 1 г почвы из каждого горизонта.
2. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц, каждую навеску почвы вносили в отдельную колбу, содержащую 100 мл стерильного физиологического раствора (0,5% раствор хлорида натрия). Колбы встряхивали на качалке в течение 30 минут.
1.2 Определение общей численности бактерий в почве
Общее количество бактерий в почве учитывали прямым счетом на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) [6;7].
1. Пять предметных стекол обезжиривали и на каждом обводили карандашом по стеклу квадрат со стороной 15 мм.
2. Бактериальную суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и равномерно распределяли по площади квадрата.
3. Препараты подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем 2 тАУ 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.
4. Подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп марки ВлБиоламВ» с масляной иммерсионной системой при увеличении 10×1,0×100.
Для прямого счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9 маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей зрения.
Общую численность бактерий в 1 г почвы (Nобщ.)определяли по формуле:
S × Σni
N общ. = z× ×v×100 [кл/г], где
S тАУ общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм2);
Σni тАУ сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;
z тАУ количество просмотренных полей зрения (15);
s тАУ площадь одного поля зрения (1089×10-6 мм2);
v тАУ объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);
100 тАУ разведение первоначального образца почвы в 100 раз.
Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.
1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов
Определение количества клеток сапротрофов (Nсапр.)проводили высевом на жидкую питательную среду тАУ мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО ВлПитательные средыВ»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки тАУ 17,9; NaCl тАУ 7,7 В± 0,3; вода дистиллированная тАУ 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди [7].Готовилиряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1 до 10-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 0С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].
Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na2HPO4 тАУ 0,8 г; KH2PO4 тАУ 0,5 г; NH4Cl тАУ 0,5 г; MgSO4 тАУ 0,2 г; CaCl2 тАУ 0,1 г; FeSO4×7H2O тАУ15 мг; дрожжевой экстракт тАУ 0,1 г ; пептон тАУ 0,2 г; агар тАУ 15 г; глюкоза тАУ 0,2 г; вода дистиллированная тАУ 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (Nолиг.) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1 до 10-9.По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ2, рассчитываемому по формуле [7]:
(niтАУn)2
χ 2 =ВаВаВаВаВа п ,
где пiтАУ число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п тАУ их среднее значение.
Различие считается значимым при χ 2 не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:
n×r
Nолиг. = v[кл/г],
где п тАУ среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r тАУ величина разведения; v тАУ объем образца, посеянного на чашку (мл).
Кроме того, рассчитывали отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.
2 Результаты и обсуждение исследования
Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.
Таблица 1
Общая численность бактерий в почвенном профиле
дерновой альфегумусовой глеевой почвы
| Горизонты (расположены от верхнего к нижнему) | Численность бактерий, кл/г сухой почвы |
| 1. | (5,35В±0,05)×109 |
| 2. | (6,2В±0,1)×109 |
| 3. | (4,8В±0,15)×109 |
| 4. | (4,5В±0,05)×109 |
| 5. | (3,65В±0,1)×109 |
Вместе с этим смотрят:
Анатомия и физиология заднего мозга. Строение и механизм кровообращения
Бiологiчне рiзноманiття людських рас
Бiологiя iндивiдуального розвитку
Бiологiя лева
Банан